научная статья по теме ВЛИЯНИЕ РЕАГЕНТА ЭЛЛМАНА И ДРУГИХ ТИОЛОВЫХ РЕАГЕНТОВ НА ТРАНСПОРТ ИОНОВ И АТP-АЗНУЮ АКТИВНОСТЬ У АНАЭРОБНО ВЫРАЩЕННЫХ КЛЕТОК ESCHERICHIA COLI Биология

Текст научной статьи на тему «ВЛИЯНИЕ РЕАГЕНТА ЭЛЛМАНА И ДРУГИХ ТИОЛОВЫХ РЕАГЕНТОВ НА ТРАНСПОРТ ИОНОВ И АТP-АЗНУЮ АКТИВНОСТЬ У АНАЭРОБНО ВЫРАЩЕННЫХ КЛЕТОК ESCHERICHIA COLI»

БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕМБРАНЫ, 2008, том 25, № 1, с. 3-10

УДК 577.352.315

ВЛИЯНИЕ РЕАГЕНТА ЭЛЛМАНА И ДРУГИХ ТИОЛОВЫХ РЕАГЕНТОВ НА ТРАНСПОРТ ИОНОВ И АТР-азную АКТИВНОСТЬ У АНАЭРОБНО ВЫРАЩЕННЫХ КЛЕТОК Escherichia coli

© 2008 г. А. Поладян, К. Трчунян, Л. Тадевосян, А. Трчунян*

Ереванский государственный университет, кафедра биофизики биологического факультета; ул. Манукяна 1,

0025 г. Ереван, Республика Армения; *электронная почта: Trchounian@ysu.am Поступила в редакцию 28.07.2007 г.

Показано, что модификация тиоловых (SH-) групп мембранных белков с помощью 5,5'-дитиобис(2-нитробензойной кислоты), или реагента Эллмана, уменьшает потоки протонов из клетки в среду и ионов калия в клетку, нарушает К+-зависимую и К,№-дициклогексилкарбодиимид-чувствительную ATP-азную активность и выработку молекулярного водорода (H2) анаэробно выращенными бактериями Escherichia coli дикого типа (рН 7.5). Однако этот реагент не влияет на указанные процессы, если остаток цистеина в b-субъединице F0 протонной Р0Р1-АТР-азы заменить на аланин. Более того, в присутствии реагента Эллмана снижается резкое падение окислительно-восстановительного потенциала среды (ОВП), обусловленное выделением H2, как при сбраживании глюкозы, так и при утилизации формиата. Подобные изменения отмечены при действии SH-реагента - сукцинимидил-6(Р-малеинидопропионамидо)-гексоната. Другой тиоловый реагент - N-этилмалеимид, подобного действия не оказывает, но потоки ионов и АТР-азная активность при этом подавляются. Полученные данные подтверждают важную роль тиоловых групп и остатка цистеина в b-субъединице F0 протонной F^-АТР-азы в протонно-калиевом обмене и образовании H2 клетками E. coli [см. Мна-цаканян Н. и др. // Биол. мембраны. 2002. Т. 19. С. 183-192]. Более того, они указывают на возможное участие SH-групп в TrkA-системе поглощения К+ и гидрогеназ 4 или 3 во взаимодействии этих мембранных белков друг с другом.

В последние годы развивается новое направление в изучении сопрягающих мембран, связанное с особенностями организации и принципами функционирования белок-белковых суперкомплексов. В одних случаях допускается формирование в мембране функциональных ансамблей ферментов, осуществляющих последовательные этапы гликолиза

[1], в других - взаимодействие двух различных транспортных или ферментативных систем, подавляющее работу одной из этих систем счет другой

[2], или же взаимодействие энергопреобразующих ферментных и энергопотребляющих транспортных белков [3, 4]. В последнем случае взаимодействие происходит в процессе передачи энергии внутри суперкомплекса. В отсутствие окислительно-восстановительных участков в соответствующих белках передача энергии может идти неспецифическим путем - посредством дитиол-дисуль-

фидных переходов (2БН--► -Б-Б- + 2Н) [4, 5].

Постулируется, что внутримолекулярные дисуль-фидные связи в белках могут переходить в межмолекулярные мостики, последующее восстановление которых с образованием тиоловых (БН-) групп ведет к выделению ~33 кДж/моль энергии [5]. Эта энергия используется энергопотребляющим белком для совершения работы по транспорту вещества, а переход 2БН--- -Б-Б- вновь ведет к фор-

мированию внутримолекулярной дисульфидной связи. Тогда цикл может повториться.

Изучая протонно-калиевый обмен в клетках Escherichia coli [6-9] и других бактерий [10-12] при сбраживании сахаров (глюкозы) в нейтральной или слабощелочной среде, мы предложили и экспериментально обосновали гипотезу, согласно которой протонная F^-АТР-аза и TrkA (или подобная) система поглощения ионов калия формируют в мембране белок-белковый суперкомплекс, внутри которого передача энергии от F^-АТР-азы к TrkA осуществляется именно через дитиол-дисуль-фидный переход [4, 7]. Донором окислительно-восстановительных эквивалентов для такого перехода служит один из конечных продуктов брожения -формиат [13, 14], окисление которого катализируется формиат-водород-лиазой (ФВЛ) [15]. Показано, что ФВЛ, состоящая из формиатдегидрогена-зы и гидрогеназы 4 (Hyf), взаимодействует с F0F1-АТР-азой [16], хотя не исключена и возможность участия ФВЛ с гидрогеназой 3 (Hyc) во взаимодействии с АТР-азой, но в других условиях [17, 18]. Результатом взаимодействия F^-АТР-азы с системой TrkA и с ФВЛ в мембране и 2SH--► -S-S-пе-

рехода внутри ферментно-транспортного суперкомплекса является также образование H2 (2Н —► —"H2). При этом активность различных форм

Таблица 1. Штаммы E. coli, использованные в работе

Штамм Генотип Источник и ссылка

DK8/pACWU 1.2* bglR thi1rel1 frp01ilv::Tn10 Р. Накамото, Вирджинский университет,

Шарлоттсвилль, США [20]

DK8/pACWU 1.2/АСу8 F** Р. Накамото [20]

* В штамм БК8 введена плазмида pACWU 1.2, содержащая оперон atp с восьмью структурными генами (atpB-C), кодирующими БдРх-АТР-азу.

** В этом штамме плазмиды кодируют Ь-субъединицу Б0, в которой остатки цистеина заменены аланином.

ФВЛ и, скорее всего, гидрогеназы 3 в нейтральной или слабощелочной среде может стимулироваться также экзогенным формиатом [14, 17, 18].

Показано влияние восстановителя дитиоловых групп - DL-дитиотреитола (ДГТ) - на потоки ионов Н+ и К+ и образование H2 клетками E. coli [7, 19], что указывает на роль SH-групп - их состояния и ди-тиол-дисульфидных превращений - в этих процессах. Выявлена также роль остатка Cys21 b-субъеди-ницы F0 протонной Р0Р1-АТР-азы в протонно-кали-евом обмене и выработке H2 бактериями: замена этого остатка на аланин приводила к нарушению обоих процессов [20]. Эта субъединица содержит один остаток цистеина, присутствие двух таких субъединиц в F0 делает возможным 2SH—> -S-S-переход.

Следует отметить, что взаимодействие ФВЛ с протонной АТР-азой установлено в независимых исследованиях, выполненных на Salmonella typh-imurium [21]. Ситуация может быть подобна той, которая предполагается для гидрогеносом [22], и иметь общебиологическое значение. Вместе с тем возможность дитиол-дисульфидного перехода в мембранных транспортных белках требует новых экспериментальных доказательств, в том числе с использованием модификации SH-групп, поиск которых и предпринят в настоящей работе. При этом использование различных тиоловых реагентов может приводить к различным результатам.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Бактерии, мембранные везикулы и реактивы.

В работе использовали штаммы E. coli, указанные в табл. 1. Бактерии выращивали в пептонной среде (2% пептон, 0.5% NaCl, 0.2% K2HPO4; рН 7.5) с 0.2% глюкозой в анаэробных условиях (закрытые сосуды, полностью заполненные ростовой средой), как описано ранее [6, 8-10, 13, 14, 16-20]. рН ростовой среды определяли с помощью рН-метра с селективным электродом типа Ш1131В ("Hanna Instruments", Португалия) и регулировали с помощью NaOH или HCl. О сбраживании глюкозы при анаэробном росте бактерий судили по секреции молочной кислоты и выделению молекулярного водорода [9]. Мембранные везикулы получали из сферо-пластов по методу Конингса и Кэбака [23].

В работе применяли D-глюкозу (Борисовский завод медицинских препаратов, г. Борисов, Беларусь), агар бактериальный, ADP и ATP (натриевые и трисовые соли), азид натрия (NaN3), бычий сывороточный альбумин, 5,5'-дитиобис(2-нитробензой-ную кислоту), или реагент Эллмана, ^№-дицикло-гексилкарбодиимид (DCC), 3-(^морфолино)про-пансульфоновую кислоту (МОПС), N-этилма-леимид (НЭМ), формиат натрия ("Sigma", США), сукцинимидил-6(0-малеинидопропионамидо)-гек-сонат (СМПГ) ("Pierce", США), пептон ("Oxoid", Великобритания или "Sigma", США), стандартные буферные растворы, трис ("Reanal", Венгрия или "Carl Roth GmbH & Co", Германия) и другие реактивы аналитической чистоты.

Изучение транспорта ионов через мембраны бактерий. Перенос ионов Н+ и К+ через мембраны бактерий в экспериментальной среде (200 мМ фос-фатно-трисовый или МОПС- буфер, рН 7.5, содержащий 0.4 мМ MgSO4, 1 мМ NaCl и 1 мМ KCl) оценивали по изменению активности соответствующих ионов в наружной среде, измеренной с помощью ион-селективных электродов [6-10, 20, 24]. Показания электродов калибровали титрованием среды малыми количествами 0.1 н HCl и 0.1 мМ KCl. Потоки ионов выражали в мМ/мин на единицу количества бактерий в объеме.

Следует отметить, что при отмывке в бескалиевом растворе с малой осмотичностью клетки лишались значительного количества К+ и при введении в экспериментальную среду с высокой осмотичностью подвергались гиперосмотическому стрессу. Такие клетки удобны для изучения транспорта ионов Н+ и К+ через мембраны [9, 21, 22].

АТР-азную активность мембранных везикул

рассчитывали по количеству высвобождаемого неорганического фосфора (Фн) после реакции мембранных везикул с ATP, как описано ранее [14, 25], и выражали в мкМ Фн/мин/мкг белка. Фн определяли спектрофотометрически по методу Тауски и Шора в незначительной модификации [25].

Окислительно-восстановительный потенциал (ОВП) среды определяли с помощью нескольких электродов: титан-силикатного (Eh) типа ЭО-021 (Гомельский завод измерительных приборов

ГЗИП, г. Гомель, Беларусь) и платинового (E'h) типа ЭПВ-01 (ГЗИП, г. Гомель, Беларусь) или PT42BNC ("Hanna Instruments", Португалия), как описано ранее [6, 7, 9, 13, 14, 16, 19, 20, 24, 26]. Электроды подготавливали к работе согласно указаниям, приводимым в паспорте к набору унифицированных редокс-метрических электродов типа ЭР-1 (ГЗИП, г. Гомель, Беларусь), в который входят электроды типа ЭПВ-01 и Э0-021. Потенциал этих электродов (относительно хлор-серебряного электрода сравнения) в контрольном растворе, содержащем смесь железоцианидов калия (0.049 М K3[Fe(CN)6] и 0.05 М K4[Fe(CN)6] ■ 3H2O, рН 6.86), составлял 254 ± 8 мВ при температуре 25°С.

Разница в показаниях этих электродов (в отличие от платинового, титан-силикатный электрод нечувствителен к молекулярному водороду или кислороду) позволяет определять выделение H2 бактериями, что выражали в мВ ОВП/мин/мг сухой массы [6, 7, 9, 13, 14, 16, 19, 20, 24, 26]. Следует заметить, что окислительно-восстановительные процессы в среде (не связанные с выделением H2 или же происходящие в отсутствие его образования при нарушениях гидрогеназы 4 [16-18]) могут воздействовать на состояние электродов, однако эт

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком