ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2011, том 58, № 5, с. 750-757
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 581.1
ВЛИЯНИЕ РЕДОКС-АГЕНТОВ НА ФОСФОРИЛИРОВАНИЕ БЕЛКОВ
ПО ТИРОЗИНУ В КОРНЯХ ГОРОХА © 2011 г. Н. В. Петрова, Ф. Г. Каримова
Учреждение Российской академии наук Казанский институт биохимии и биофизики Казанского научного центра
РАН, Казань Поступила в редакцию 03.02.2011 г.
Посттрансляционные модификации белков и их взаимодействие — важнейший способ регуляции активности белков и их надмолекулярных комплексов. В работе методами одномерного и двумерного электрофореза и иммуноблоттинга с использованием высокоспецифичных антител (PY20) выявлено более 50 фосфотирозиновых растворимых полипептидов корней гороха (Pisum sativum L., сорт Труженик), у которых уровень фосфорилирования белков по тирозину изменялся при действии in situ редокс- и алкилирующего агентов.
Ключевые слова: Pisum sativum — посттрансляционные модификации белков — редокс-регуляция — фос-форилирование белков по тирозину
ВВЕДЕНИЕ
Фосфорилирование белков, ключевая реакция сигнальных систем клеток, является наиболее хорошо охарактеризованной посттрансляционной модификацией (ПТМ) белков. Фосфорилирование белков по тирозину — критический этап в регуляции клеточной пролиферации и дифферен-цировки и управлении многими процессами для поддержания клеточного гомеостаза [1].
Уровень фосфорилирования белков по тирозину обратимо регулируется активностью тирози-новых протеинкиназ (ТПК) и тирозиновых про-теинфосфатаз (ТПФ). ТПКазная активность была показана в этиолированных растениях гороха [2] и табака [3]. Рецепторная протеинкиназа двойной специфичности, фосфорилирующая белки по серину/треонину и тирозину, PRK1 была обнаружена в петунии, ее киназный домен фосфорилировался по тирозину [4]. Классификация и функциональная аннотация эукариотиче-ских протеинкиназ [5] на сегодня включает в рассмотрение истинные ТПК, найденные в растениях Arabidopsis thaliana (2 вида ТПК), Oryza sativa ssp. indica (6 видов ТПК) и O. sativa ssp. japónica
Сокращения: ПВДФ мембраны — поливинилдифторные мембраны, ПП — полипептид, ТПК — тирозиновые проте-инкиназы, ПТМ — посттрансляционные модификации, ТПФ — тирозиновые протеинфосфатазы, ТБСТ — Трис-бу-фер солевой с Твином 20, ТЕМЕД — тетраметилэтилендиа-мин, ФМСФ — фенилметилсульфонилфторид, ФТПП — фосфотирозиновые полипептиды, УТФ — уровень фосфорилирования белков по тирозину.
Адрес для корреспонденции: Каримова Фатима Габдуллазянов-на. 420111 Казань, а/я 30. Казанский институт биохимии и биофизики КазНЦ РАН. Факс: +7 (843) 297-73-47; электронная почта: karimova@mail.knc.ru
(7 видов ТПК). Авторы полагают, что строгим доказательством функционирования истинных ТПК в растениях служат данные о присутствии в белках растений SH2 (src-homology2) и PTB (protein tyrosine binding) доменов, которые связываются с фосфотирозиновыми белками с образованием мультибелковых комплексов (два S^-до-мена в A. thaliana и один S^-домен в O. sativa). Исследования in silico [6] показали, что геном растений A. thaliana содержит около 4% генов, кодирующих истинные ТПК.
Хорошо охарактеризованы на молекулярном уровне специфические ТПФ растений [7]. Реком-бинантная AtPTPl дефосфорилировала фосфо-тирозин, но не фосфосерин/фосфотреонин. Подобно ТПФазам клеток животного происхождения SH-группа в каталитическом центре AtPTPl была существенна для каталитической активности, а такой специфический ингибитор ТПФаз, как ванадат, подавлял активность AtPTPl [7]. Данные фосфопротеомного анализа выявили сходное количественное соотношение фосфосе-риновых, фосфотреониновых и фосфотирозино-вых белков в растениях и в тканях млекопитающих [8].
Участие фосфорилирования белков по тирозину было показано в регуляции различных физио-лого-биохимических процессов растений: активности фитохрома, соматического эмбриогенеза клеток моркови, в морфогенности клеток культур гречихи, прогрессии фаз клеточного цикла, активности цитоскелетных белков, активации Н+-АТФа-зы плазматических мембран (ПМ) A. thaliana, открытости устьиц, пролиферации клеток гипоко-тилей A. thaliana, взаимодействии 14-3-3 белков с
Н+-АТФазой ПМ, развитии семян А. ЛаЫапа после прорастания, брассиностероид-индуциро-ванного изменения уровня фосфорилирования белков по тирозину (УТФ) субъединиц РБФК/О в листьях гороха, прорастания пыльцы и роста пыльцевой трубки у растений табака (см. обзор [9]). Все вышеизложенное указывает на существенную роль фосфорилирования белков по тирозину в клеточном метаболизме растений.
Активность клеточных белков регулируется более, чем одним типом ПТМ, которые могут быть конкурентны, например, метилирование белков может вызывать в них конформационные изменения, обусловливая недоступность сайтов фосфорилирования. Другие типы ПТМ, наоборот, могут осуществляться лишь после предшествующей ПТМ. Одновременно могут осуществляться фосфорилирование и тиолирование белков, так как тиолирование происходит по остаткам цистеина, тогда как фосфорилирование селективно для остатков серина, треонина и тирозина [10].
Наряду с фосфорилированием редокс-зависи-мая ПТМ белков влияет на множество аспектов регуляции клеточного гомеостаза во всех типах живых организмов, включая каждую стадию развития растений [11]. В растениях продукция Н2О2 и других активных форм кислорода является ответной реакцией на экзогенные стимулы, такие как инфицирование патогенами и абиотические стрессоры [12]. В настоящее время внутриклеточный редокс-статус определяется как критический параметр, определяющий клеточные ответы эу-кариот, а специфическая и обратимая окислительная модификация белков играет ключевую роль в нормальной клеточной физиологии. Число выявленных редокс-регулируемых белков растений увеличивается с каждым годом. Выявлено, что преимущественным механизмом редокс-ре-гуляции реакций сигнальной трансдукции и клеточного метаболизма является посттрансляционная модификация тиоловых групп остатков ци-стеина белков перекисью водорода [13].
Изучение роли ПТМ белков и их взаимодействия является одной из важнейших тем современных исследований клеточной активности. Целью представленной работы было изучение влияния редокс-зависимой ПТМ на уровень фосфорилирования белков по тирозину в корнях гороха. Полученные нами результаты указывают на редокс-зависимость фосфорилирования белков по тирозину.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Растения гороха (Pisum sativum L., сорт Труженик) выращивали в условиях 14-часового фотопериода на 0.25 нормы питательной среды Хоглан-
66
45 -
3 36-
§ 29
24 Н 20.1 14.2
Рис. 1. Влияние поранения (отрезания) на фосфорилирование по тирозину растворимых полипептидов корней 7-дневных растений гороха. Нагрузка белка на трек при разделении при помощи 1DE составила 25 мкг. 1, 2 — автограф фосфорилиро-ванных по тирозину полипептидов; 3, 4 — окрашенные Кумасси R-250 полипептиды. 1, 3 — нативные корни, 2, 4 — отсеченные корни (10 мин после отрезания).
да—Арнона I при интенсивности освещения 10 клк в течение 7 дней. Влияние редокс-агентов на фосфорилирование полипептидов выявляли на отсеченных от побегов корнях. Отсеченные корни инкубировали 5 или 10 мин в среде роста с эффекторами или без них (контроль). В качестве эффекторов использовали экзогенные соединения: дитиотрейтол, перекись водорода, аминот-риазол, пролин, йодоуксусную кислоту. После инкубации с эффекторами корни фиксировали в жидком азоте. Для определения фосфопептидов нативных корней целые растения переносили в кюветы с жидким азотом, замороженные корни отсекали от побегов.
Кончики корней (8 мм) гомогенизировали в среде, содержавшей: 50 мМ Hepes—КОИ, рН 7.5; 1 мМ ДТТ; 1 мМ фенилметилсульфонилфторид (ФМСФ); 10 мМ ЭГТА; 0.1 мМ ортованадат; 1 мМ теофиллин; 3% поливинилпирролидон. Гомоге-нат центрифуговали при 12000 g в течение 10 мин при 5°С. Супернатант использовали для приготовления образца для одномерного электрофореза (1DE) при разделении белков в 6—16% ПААГ (как описано в [15]). Количество белка, нанесенного на трек, составляло 25 мкг.
Для разделения белков методом двумерного электрофореза (2DE) белки супернатанта осаждали ледяным 80% ацетоном. Осажденный белок промывали 3 раза ледяным ацетоном, растворяли в изоэлектрофокусирующем буфере (8 М мочевина, 2 М тиомочевина, 2% ХАПС (3.3[(3-холами-
(а)
66
S 45
Я 36
4 о
5 29 24
20.1
14.2
4 pH 8
(б)
П
м
66 -
45
36 H
<3 29
24 20.1
14.2
pH (в)
66
45
36
§ 29
24 20.1
14.2
pH
Рис. 2. Влияние редокс-агентов in situ на фосфорили-рование по тирозину растворимых полипептидов отрезанных корней 7-дневных растений гороха. Время инкубации — 10 мин. а, б — автографы фосфо-рилированных по тирозину полипептидов: а — контроль, б — ДТТ (10 мМ); в — окрашенные Кумасси R-250 полипептиды (нагрузка белка — 300 мкг — для всех проб одинакова).
допропил)диметиламмоний]-1-пропансульфо-нат), 0.2% амфолита pH 3-10, 3 мМ ДТТ и 20 мМ Трис-буфер солевой с Твином 20 (ТБСТ)) и разделяли методом 2DE, как описано ранее [14]. Для выявления белков, фосфорилированных по тирозину, использовали иммуноблоттинг с антителами PY20 ("Amersham", Англия), как описано ранее [14]. Высокая (микромолярная) специфичность использованных антител показана нами ранее с использованием методов электрофореза [15] и конфокального лазерного сканирующего микроскопа [16]. Значения удельного фосфорилирования белков по тирозину выражали как отношение оптической плотности фосфорилиро-ванного белка (хемилюминесценции) на рентгеновской пленке к оптической плотности белка на мембране, окрашенной Кумасси R-250 (с использованием программы Flicker (http:// open2dprot.sourceforge.net.Flicker) и пакета программ Excel). Эксперименты проводили в двух-трех повторностях; приведены результаты типичного опыта.
В работе использованы Hepes, Трис, глицин, ДТТ, поливинилпирролидон, ДДС, тетраметил-этилендиамин (ТЕМЕД), бромфеноловый синий, персульфат аммония, акриламид, Кумасси R-250, а также метилен-бис-акриламид фирмы "Bio-Rad" (США). Моноклональные антитела против фосфотирозина (клон PY20), поливинил-дифторные мембраны (ПВДФ мембраны), хеми-люминесцентный реагент (ECL-реагент), Т
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.