научная статья по теме ВЛИЯНИЕ РЕГУЛЯТОРА РОСТА РАСТЕНИЙ СТИФУН НА АККУМУЛЯЦИЮ КАДМИЯ ПРОРОСТКАМИ ЗЕРНОВЫХ КУЛЬТУР Сельское и лесное хозяйство

Текст научной статьи на тему «ВЛИЯНИЕ РЕГУЛЯТОРА РОСТА РАСТЕНИЙ СТИФУН НА АККУМУЛЯЦИЮ КАДМИЯ ПРОРОСТКАМИ ЗЕРНОВЫХ КУЛЬТУР»

АГРОХИМИЯ, 2011, № 5, с. 76-83

УДК 631.811.98:546.48:633.1

ВЛИЯНИЕ РЕГУЛЯТОРА РОСТА РАСТЕНИЙ СТИФУН НА АККУМУЛЯЦИЮ КАДМИЯ ПРОРОСТКАМИ ЗЕРНОВЫХ КУЛЬТУР

© 2011 г. О.И. Яхин1, А.А. Лубянов12, И.А. Яхин1, Б.Н. Постригань1, А.В. Чемерис1, В.А. Вахитов1, Р.А. Батраев1

1 Институт биохимии и генетики УНЦ РАН 450054 Уфа, просп. Октября, 71, Россия E-mail: yakhin@anrb.ru 2 Оренбургский государственный университет, Уфимский филиал 450054 Уфа, просп. Октября, 67, Россия

Поступила в редакцию 30.09.2010 г.

Применение регулятора роста растений стифун уменьшало накопление кадмия в проростках пшеницы и риса при их выращивании на растворах ацетата кадмия. При применении стифуна выявлено уменьшение ингибирующего действия ионов кадмия на морфометрические параметры проростков. Установлено, что без загрязнения среды кадмием обработка регулятором роста не вызывала изменения активности транскрипции гена фитохелатинсинтазы (OsPCS1) в проростках риса. Стифун уменьшал индуцированную кадмием транскрипционную активность гена OsPCS1, что могло быть сопряжено с выявленной меньшей аккумуляцией кадмия при действии данного регулятора роста. Ключевые слова: регулятор роста растений стифун, кадмий, аккумуляция, проростки, зерновые культуры.

ВВЕДЕНИЕ

Распространение тяжелых металлов (ТМ) в окружающей среде происходит вследствие естественных природных процессов и антропогенной деятельности. Негативные эффекты ТМ на растения обусловлены их фитотоксическим действием [1, 2] и накоплением в продукции растениеводства, что представляет опасность для здоровья человека. Одним из опаснейших ксенобиотиков среди ТМ является кадмий. При его аккумуляции в организме человека может происходить нарушение функции легких, почек, нервной и генеративной систем, повреждение костной ткани; обсуждается возможность его канцерогенного действия [3]. Одним из источников поступления кадмия в организм человека являются культивируемые растения. В связи с этим задача уменьшения накопления кадмия в хозяйственно-полезной части культурных растений и повышения их устойчивости к его токсическому действию является актуальной.

Известно, что для уменьшения негативного влияния ТМ на рост сельскохозяйственных культур и снижения их аккумуляции в культурных растениях используют различные методы и приемы, в частности, известкование почв, внесение хелатирующих соединений и др. В последние годы активно исследуют возможность применения регуляторов роста растений (РРР) для повышения устойчивости сель-

скохозяйственных культур к тяжелым металлам и снижения их аккумуляции.

Цель работы - оценка физиологической активности регулятора роста стифун [4] в условиях токсического действия ионов кадмия на проростки зерновых культур. Исследовали влияние стифуна на морфометрические параметры проростков пшеницы и аккумуляцию ими кадмия, а также сопряженность экспрессии гена фитохелатинсинтазы (PCS1) и накопления кадмия проростками риса в модельных опытах.

МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ

Объекты исследования - проростки пшеницы (Triticum aestivum L.) сорта Ирменка и риса (Oryza sativa L.) сорта Рапан.

Препаративную форму стифуна (водорастворимый порошок) получали по ранее описанной методике [4] и применяли далее в экспериментах в оптимальной физиологической концентрации (33 мг/л), установленной в предварительных опытах, при которой наблюдали наиболее выраженные эффекты. Семена растений перед посевом стерилизовали в 70%-ном этаноле. Применение регулятора роста включало обработку 2-суточных проростков его водным раствором в течение 1 ч. Затем проростки помещали на раствор ацетата кадмия (378 мкМ Cd)

на 24, 48, 72, 96 ч и инкубировали при 25-27 °С. Контроль - дистиллированная вода. В опытах определяли линейные размеры, сырую и сухую биомассу проростков. Индекс устойчивости растений (/Сй) к присутствию кадмия в среде оценивали по отношению сухой массы растения в варианте с присутствием металла к массе растения в контроле [1].

Количественное определение содержания Сё проводили методом атомно-абсорбционной спек-трофотометрии с пламенным атомизатором АА5-30 (Carl Zeiss, Германия). В данной методике на всех этапах работы использовали дистиллированную воду. В фарфоровые тигли добавляли воду и 0.5 мл азотной кислоты. Кипятили 1 ч, выливали, споласкивали водой и прокаливали в муфельной печи при 200 °С. В колбы на 50 мл добавляли воду и 1 мл азотной кислоты. Кипятили 1 ч и споласкивали водой, затем прокаливали в сушильном шкафу. Взвешивали фарфоровые тигли после прокаливания. Пробы растений помещали в фарфоровые тигли, вновь взвешивали, помещали в холодную муфельную печь. Сначала озоление проводили при температуре 200 °С в течение 2 ч (до обугливания проб), затем - при 525-550 °С в течение 5-6 ч. После охлаждения тиглей зольный остаток смачивали 0.5 мл воды, добавляли 10 мл разбавленной (1 : 1) азотной кислоты и кипятили 30 мин. Затем из тиглей зольный остаток фильтровали через фильтр "белая лента" в мерные колбы емкостью 50 мл. Несколько раз ополаскивали водой тигли и фильтры и общий объем доводили до 50 мл.

Одновременно с обработкой пробы проводили "холостой" опыт, заменяя анализируемую пробу водой. К 100 мл воды добавляли 6 мл азотной кислоты, перемешивали, кипятили в течение 20 мин. Далее фильтровали в колбы на 100 мл и доводили до метки водой. Приготовленную пробу распыляли в пламени горелки и снимали показания на табло прибора. После 5 последовательных измерений анализируемых проб распыляли один из градуировочных растворов для контроля стабильности работы прибора. Если измеренная величина выходила за пределы градуи-ровочного графика, то пробы разбавляли.

Массовую концентрацию металла (Х, мкг/г) рассчитывали по формуле:

X=

(c - cюл) $ V

m

где: С - концентрация Сё в исследуемой пробе, полученная прямым отсчетом с табло прибора, мг/дм3; Схол - результат анализа "холостой пробы", мг/дм3; V - объем исследуемого раствора, мл; Ат -масса растительной навески. Массу навески растения (дт) находили из соотношения:

дт = т1 - т2,

m1 - масса фарфорового тигля с навеской, г; m2 -масса фарфорового тигля, г.

При изучении гена фитохелатинсинтазы риса PCSI - NC_008396 (NCBI) применяли метод поли-меразной цепной реакции в режиме реального времени (ПЦР-РВ) с использованием FRET-эффекта на платформе "УФА" [5]. Из растений РНК выделяли тризоловым методом (Invitrogen, США). Навеску растений растирали в агатовой ступке с жидким азотом до порошкообразного состояния, не допуская оттаивания растительного материала, переносили в полипропиленовую пробирку объемом 2 мл (Eppendorf, Германия), содержащую 1 мл реактива TRIzol (Invitrogen, США) и перемешивали при энергичном встряхивании, после чего пробирки выдерживали при температуре 4 °С в течении 1015 мин. Пробирки помещали в рефрижераторную центрифугу (Eppendorf, Германия) на 10 мин при 13 000 об./мин. К надосадочной жидкости добавляли хлороформ, встряхивали и снова центрифугировали. Верхний водно-солевой слой, содержащий РНК, отбирали пипеткой и повторно депротеини-зировали хлороформом; эту операцию повторяли 3-4 раза. Отбирали водно-солевую фазу и после осаждения изопропанолом осадок РНК промывали 70%-ным этанолом. При необходимости удаление примеси ДНК осуществляли обработкой ДНК-азой.

Образцы РНК были выровнены по спектру поглощения при 260 нм.

Для детекции ПЦР-продукта используют флуоресцентные красители, обеспечивающие флуоресценцию, прямо пропорциональную количеству нарабатываемого ПЦР-продукта. ПЦР в реальном времени на платформе "УФА" проводили в 20 мкл реакционной смеси, содержащей: буфер (40 мМ Трис-HCl pH 8.0, 2.5 мМ MgCl2, 25 мМ KCl), 20 фмоль ДНК, 1 ед. акт. ST-полиме-разы, по 0.5 пмоль прямого и обратного прайме-ров, меченных разными флуорохромами (донором и акцептором), по 0.25 мМ каждого из дНТФ и соответствующее количество деионизованной воды в ДНК-амплификаторе с оптическим модулем iCycler iQ (Bio-Rad, США).

Для проведения ПЦР праймеры были подобраны "на стыке" между первым и вторым экзоном кодирующей части гена фитохелатинсинтазы таким образом, чтобы исключить возможный вклад геномной ДНК. Синтез кДНК проходил в одну реакцию, поскольку использовали ST-полимеразу, обладающую также ревертазной активностью. Условия реакции подбирали в соответствии с имеющимися праймерами: денатурация при 94 °С, 30 сек; отжиг при 58-60 °С, 25 сек; элонгация при 72 °С, 35 сек в 36 циклах. Результаты получали в виде сигмообраз-ных кривых амплификации и кривых плавления.

Длина корней

72 ' 96 Время экспозиции, ч 1 Контроль Ацетат кадмия ] Ацетат кадмия + стифун

Длина побегов -Контроль.......Ацетат кадмия

- - ■ Ацетат кадмия + стифун

Сырая масса

72 96

Время экспозиции,'

1 Контроль "" Ацетат кадмия ] Ацетат кадмия + стифун

Сухая масса -Контроль.......Ацетат кадмия

- - ■ Ацетат кадмия + стифун

72 96 ^

Q Время экспозиции, ч ^

■-1 Контроль özc Ацетат кадмия

CZZZZ3 Ацетат кадмия + стифун

-Контроль .......Ацетат кадмия

- - - Ацетат кадмия + стифун

Рис. 1. Влияние стифуна на морфометрические показатели роста проростков пшеницы при экспозиции на растворе ацетата кадмия: (а) - линейные размеры проростка, (б) - биомасса побегов, (в) - биомасса корней.

Температура отжига праймеров, а также температура плавления целевых продуктов варьировала в разных экспериментах в зависимости от GC-соста-ва используемых олигонуклеотидов.

Статистическую обработку результатов проводили с использованием программы Microsoft Excel. Все опыты проводили не менее чем в трех биологических повторностях и четырех-пяти - аналитических. В иллюстрациях и таблицах представлены средние арифметические величины и их стандарт-

ные отклонения. Статистическую значимость между вариантами в экспериментах оценивали с использованием ¿-критерия Стьюдента.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Ацетат кадмия в исследуемой концентрации оказывал ингибирующее действие на рост проростков пшеницы (рис. 1), которое влияло сильнее на корни, чем на побеги. При предобработке проростков стифуном наблюдали тенденцию предотвращения негативного действия кадмия на линейные размеры, сырую и сухую массу проростков.

При действии кадмия отмеч

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком