АГРОХИМИЯ, 2010, № 7, с. 33-40
УДК 631.98:581.143.6:572.226
ВЛИЯНИЕ РЕГУЛЯТОРОВ РОСТА НА РЕГЕНЕРАЦИОННУЮ СПОСОБНОСТЬ ТКАНЕЙ ОРГАНОВ ТЮЛЬПАНА В КУЛЬТУРЕ IN VITRO
© 2010 г. А.Ш. Ахметова, Р.К. Байбурина, Л.Н. Миронова
Ботанический сад-институт Уфимского научного центра РАН 450080 Уфа, Башкортостан, Россия E-mail: al_sham@mail.ru
Поступила в редакцию 02.09.2010 г.
Показана возможность эффективного применения метода культуры тканей для микроклонального размножения тюльпана. Получен прямой морфогенез на поверхности чешуй, фрагментированных из стерильных микролуковиц. Выявлена эффективная питательная среда для индукции развития побегов на поверхности чешуй микролуковиц. Показано, что клетки специализированных тканей сортового тюльпана в культуре in vitro способны к каллусогенезу и морфогенезу. Наибольшую способность к морфогенезу проявили экспланты завязи и цветоложа. Для указанных эксплантов подобраны оптимальные питательные среды, содержащие цитокинины 6-БАП, кинетин и ауксин НУК. Разработанный метод микроразмножения сортового тюльпана позволяет получать от каждого экспланта за 1 год до 120 растений-регенерантов.
Ключевые слова: фитогормоны, регенерационная способность, органы растения, тюльпан.
ВВЕДЕНИЕ
В современном цветоводстве особой популярностью и высоким спросом пользуются высокодекоративные сортовые растения, в том числе тюльпаны. Для внедрения перспективных сортов в промышленное производство и использования их в селекции возникает необходимость разработки новых интенсивных технологий их размножения. Эта проблема может быть решена методом клонального микроразмножения. Изучение морфогенетических потенций разных органов и тканей растения позволяет выявить оптимальную схему, метод и условия размножения in vitro.
Разработаны несколько методов размножения растений in vitro. В одних из них используют естественные способности луковицы (чешуй, донца, пазушных почек) тюльпана создавать молодые луковички. Изучено размножение in vitro чешуй и донца луковиц тюльпана Геснера (Tulipa gesneriana L.) и сорта Пауль Рихтер [1]. В Японии разработан метод образования адвентивных почек и пролиферации луковичек на вырезанных сегментах чешуй тюльпана лесного (T. silvestris L.) и сорта Apeldo-orn [2]. Разработана методика культивирования меристем из пазушных почек сортовых тюльпанов [3]. Используются и другие части растения для получения культуры in vitro, главным образом сегменты листьев, тычиночные нити, незрелые завязи
генеративного происхождения [4, 5]. Генеративные органы, отличающиеся высоким содержанием эндогенных фитогормонов, обладают наибольшей ре-генерационной способностью.
Использование в качестве эксплантов незрелых зародышей предоставляет другие возможности. Многие опыты по гибридизации были неудачными потому, что зародыши гибли на определенной стадии развития вследствие несовместимости эндосперма и зародыша [6]. При помощи метода культуры зародышей удалось получить ряд гибридных форм тюльпанов от 5-ти комбинаций скрещивания [7].
В связи с вышеизложенным всестороннее исследование морфогенетических потенций различных органов и тканей растений тюльпана и способов их регулирования в культуре in vitro является актуальным.
Цель работы - оценка генетической потенции к морфогенезу in vitro тканей вегетативных и генеративных органов тюльпана, влияния фитогормонов на этот процесс и выявление оптимальных условий для реализации этих потенций.
МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ
Эксперимент проводили с сортовыми тюльпанами, собранными на коллекционном участке Ботанического сада-института Уфимского НЦ РАН. Изучено три типа эксплантов:
1. Семена гибридных форм тюльпана, полученных от принудительного скрещивания с участием сортов зарубежной селекции: New Look x Marietta. Использованные сорта принадлежат, согласно Международной классификации 1987 г., к 2-м классам Бахромчатых и Лилиецветных;
2. Сегменты оснований семядолей, чешуй, фраг-ментированных из стерильных микролуковиц гибридных сеянцев New Look x Marietta;
3. Различные органы и ткани растений тюльпана сорта Lucky Strike, собранных в фазе бутонизации (конец апреля-начало мая). В культуру in vitro вводили сегменты листовых пластинок ассимилирующих листьев, цветоносов и неокрашенные бутоны, из последних фрагментировали цветоложе, завязь, рыльце и околоцветник.
Перед стерилизацией подготовку к дезинфекции растительного материала проводили по схеме: промывка в растворе детергента - 20 мин, после чего в течение 15 мин выдерживали в 0.1%-ном растворе марганцевокислого калия и 15-20 мин в проточной воде. Работу в асептических условиях, стерилизацию питательных сред и посадочного материала проводили согласно имеющимся рекомендациям [8-10]. Для семян было испытано несколько режимов стерилизации (табл. 1). Использованные стерилизующие растворы (70%-ный этанол, 0.1%-ный диацид, 3%-ный H2O2, 0.2%-ный AgNO3) по-разному влияли на жизнеспособность семян и последующее развитие проростков. На основании полученных результатов была выбрана эффективная схема стерилизации (вариант 1), которую использовали при проведении дальнейших экспериментов. Стерилизация семян тюльпана в 3%-ном растворе пе-роксида водорода снижала их жизнеспособность по сравнению с 0.1%-ным раствором диацида и 0.2%-ным раствором нитрата серебра. Максимального числа жизнеспособных (70%) и минимального числа инфицированных (2.0%) семян удалось достичь при последовательном выдерживании семян в 70%-ном этаноле в течение 1 мин и 0.1%-ном растворе диацида в течение 8 мин. Наибольшая инфициро-
ванность и низкая жизнеспособность выявлена у семян, стерилизованных с использованием Н202 и АЕКОз.
Эффективность стерилизации (последовательное выдерживание в 70%-ном растворе этанола в течение 1 мин и 0.1%-ном растворе диацида в течение 12 мин) сегментов листовых пластинок ассимилирующих листьев, цветоносов и неокрашенных бутонов в разных опытах составляла от 70 до 90%, зависела от зараженности и возраста экспланта и для молодых тканей была максимальной. Бутоны стерилизовали целиком, после чего в стерильных условиях с помощью пинцета фрагментировали цветоложе, завязь, рыльце и околоцветник, которые разрезали на несколько частей и помещали на твердую питательную среду. В случае тканей края эксплантов, которые соприкасались со стерилизующим раствором, асептически удаляли с помощью стерильного скальпеля, наносили поранения и помещали на среды для каллусогенеза.
Для проращивания семян была выбрана безгормональная питательная среда (М5), содержащая минеральные соли по Т. Murashige апё Е Scoog [11]. Стерильные экспланты культивировали сначала в темноте при низкой положительной температуре 10°С. Для интенсификации роста проростков и формирования на них микролуковиц через 20 сут проросшие семена были пересажены на питательную среду МБ, дополненную 6-бензиламинопу-рином (6-БАП) в концентрации 2.0 мг/л и помещены на свет при температуре 26°С, 16-часовом фотопериоде и 70%-ной относительной влажности воздуха.
Выращенные сеянцы тюльпана были использованы для получения новых типов эксплантов: сегментов оснований семядолей и чешуй микролуковиц. Их помещали (по 30 шт. в каждом варианте) на модифицированные среды МБ, содержащие 6-БАП, кинетин, ИУК (индолилуксусную кислоту) и НУК (а-нафтилуксусную кислоту) в различных комбинациях и концентрациях.
Таблица 1. Влияние стерилизующих растворов на жизнеспособность семян in vitro, %
Вариант Стерилизующие растворы, экспозиция Жизнеспособные Инфицированные Некротизиро-ванные
1 70%-ный этанол 1 мин, 0.1%-ный диацид 8 мин 70 2.0 28
2 70%-ный этанол 1 мин, 3%-ный Н2О2 15 мин 21 58 21
3 70%-ный этанол 1 мин, 0.1%-ный диацид 6 мин 58 22 21
4 70%-ный этанол 1 мин, 0.2%-ный AgN03 10 мин 38 46 16
Для инициации морфогенетических процессов стерильные экспланты фрагментов бутонов, листьев и цветоносов были помещены на модифицированные среды MS, содержащие гидролизат казеина и дрожжевой экстракт в концентрации по 50.0 мг/л, мезоинозитол - 100.0 мг/л, сахарозу - 30.0 мг/л и бактоагар - 6.0 мг/л. В отличие от других тканей, меристема в условиях in vitro способна к пролиферации - увеличению количества клеток путем активных митотических делений. Кроме того, эта ткань генетически стабильна на всех этапах культивирования in vitro. Для выявления роли гормонов в инициации каллусогенеза использовали ауксины: 2,4-Д (2,4-дихлорфеноксиуксусную кислоту), НУК, ИУК в концентрациях от 0.05 до 5.0 мг/л и цитокинины кинетин, 6-БАП в концентрациях от 0.2 до 10.0 мг/л в различных комбинациях. Всего испытано 25 вариантов питательной среды MS, и для каждого варианта введено по 30 эксплантов. Экспланты культивировали при температуре 26°С при 16-часовом фотопериоде. Относительная влажность воздуха составила 70%. Для образования кал-лусной ткани в условиях in vitro клетки экспланта (фрагмент ткани или органа) должны пройти процесс дедифференциации, т.е. утратить клеточную специализацию in vitro. Обязательным условием дедифференциации растительной клетки и превращения ее в каллусную является добавление в питательную среду ауксинов и цитокининов. Ауксины вызывают процесс дедифференциации клетки, подготавливающей ее к делению, цитокинины -пролиферацию, т.е. деление дедифференцирован-ных клеток или каллусогенез. Если в питательную среду без гормонов поместить эксплант, состоящий из специализированных (дифференцированных) клеток, то деления клеток не произойдет, и кал-лусная ткань не образуется. Основным условием, определяющим переход от пролиферации каллуса к органогенезу, к регенерации, является соотношение гормональных факторов в питательной среде. При высокой величине отношения экзогенных гормонов цитокинин : ауксин происходит образование побегов, при низкой - индуцируется корнеобразо-вание, при средней - происходит пролиферация каллуса, т.е. его деление, рост и в дальнейшем побегообразование. Через 25-30 сут культивирования сформированный каллус, согласно цитогистологи-ческому контролю представленный главным образом меристематической тканью, переносили на питательную среду II. Данная среда также составлена по прописи Мурасиге-Скуга с
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.