ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2013, том 49, № 3, с. 236-241
УДК 581.138.1
ВЛИЯНИЕ РИЗОБИАЛЬНОЙ (Rhizobium leguminosarum) ИНОКУЛЯЦИИ И ИОНОВ КАЛЬЦИЯ НА АКТИВНОСТЬ НАДФН-ОКСИДАЗЫ В КОРНЯХ ЭТИОЛИРОВАННЫХ ПРОРОСТКОВ ГОРОХА (Pisum sativum L.)
© 2013 г. А. К. Глянько, А. А. Ищенко
Сибирский институт физиологии и биохимии растений СО РАН, Иркутск, 664033
e-mail: akglyanko@sifibr.irk.ru Поступила в редакцию 11.05.2012 г.
Показаны изменения в функциональной активности НАДФН-оксидазы в микросомальной фракции корней этиолированных проростков гороха под влиянием ризобиальной инокуляции и ионов кальция (Са2+). Обнаружены колебания активности фермента на среде с экзогенным источником Са2+ (СаС12, 100 мкМ): повышение через 5 и 20 мин и снижение через 10 и 30 мин. Хелатор кальция (этиленгликоль тетрауксусная кислота, 100 мкМ) способствовал снижению активности фермента на фоне экзогенного кальция. Ризобиальная инокуляция в 3.9 раза увеличивала активность фермента через 5 мин по сравнению с контролем (без инокуляции). Активатор Са2+-каналов амиодарон (300 мкМ) и блокатор Са2+-каналов — хлорид лантана (400 мкМ), снижали активность НАДФН-оксидазы на фоне ризобиальной инокуляции до уровня контроля (без инокуляции). Делается вывод об участии Ca2+ и активных форм кислорода в регуляции активности мембранной НАДФН-оксидазы в корнях проростков гороха.
DOI: 10.7868/S0555109913030082
Мутуалистический симбиоз между клубеньковыми бактериями (КЫ1оЫиш leguminosarum) и бобовыми растениями (Leguminosae) — уникальное биологическое явление, изучение теоретических основ которого важно в практическом аспекте для получения высоких урожаев бобовых растений, повышения азотного плодородия почв, сохранения экологической стабильности почвенной среды. В отличие от патогенеза, бо-бово-ризобиальный симбиоз — полезное для обоих организмов сожительство. Проникая в клетки растения, клубеньковые бактерии способствуют формированию "эндоэкологической ниши" в виде корневых клубеньков, в которых ризобии фиксируют атмосферный азот (N2) за счет энергетических ресурсов растения-хозяина, давая растению взамен усвояемый им минеральный азот ^И3).
Формирование бобово-ризобиального симбиоза требует успешного инфицирования корней бобовых растений ризобиями (микросимбионт) и образования симбиотических структур. Это сложные постепенно развивающиеся процессы, осуществляемые клубеньковыми бактериями под контролем растения-хозяина (макросимбионт) [1, 2].
Необходимым условием для инфицирования и образования клубеньков (нодуляция) бобовых растений является прикрепление ризобий к кончику корневого волоска. У адсорбированных на поверхности корня бактерий под влиянием специфических для ризобий растительных флавоно-
идов (дайдзеин, апигенин, лютеолин и др.) инициируется экспрессия ^ой-генов, конечными продуктами которых являются бактериальные сигнальные молекулы — липохитоолигосахари-ды — Nod-факторы (NF). Эти сигналы воспринимаются эпидермальными клетками корня, на плазмалемме которых локализованы рецепторы NF — рецептор-подобные киназы (receptor-like kinases, RLK): LysM RLK и LRR (leucine rich repeat) RLK. Первая из них содержит внеклеточные лизиновые мотивы, вторая (LRR) — богата лейци-новыми повторами [3]. Наличие двух (или более) рецепторов в эпидермальных клетках объясняется, вероятно, их разной ролью в инициации включения сигнальных путей, ведущих к инфицированию растения ризобиями и образованию корневых клубеньков [4, 5]. Молекулярное взаимодействие NF и RLK включает определенные ответы макросимбионта, такие, как ионные изменения, защелачивание цитоплазмы, колебания концентрации Са2+ и экспрессия генов, которые приводят к бактериальной инвазии и формированию клубенька [6, 7]. В первые минуты после воздействия на клетки корня очищенного NF или ризобий наблюдается быстрый транспорт ионов кальция в цитоплазму через плазмалемму, что сопровождается деполяризацией мембраны и оттоком ионов хлора и калия из цитоплазмы во внеклеточное пространство корневых волосков. Колебания в концентрации цитозольного Са2+ наблюдаются спустя 10—15 мин после индукции потока
кальция в цитоплазму [8]. Подобные изменения в концентрации Са2+ вызывают (с участием активированной Са2+-кальмодулинзависимой киназы) фосфорилирование белков — транскрипционных факторов, дальнейшую трансдукцию МБ-сигнала и экспрессию ядерных симбиотических генов [9]. Таким образом, этим самым Са2+-сигнальная система участвует в рецепции симбиотических сигналов на самых ранних стадиях взаимодействия симбионтов.
Кроме ионов Са2+ сигнальную роль на ранних этапах симбиоза играют активные формы кислорода (АФК), такие, как супероксидный анион-радикал (02-), пероксид водорода (Н2О2) и др. Показано, что АФК активируют Са2+-каналы, которые являются сигнальным механизмом, ведущим к полярному росту корневого волоска [10]. Многочисленные исследования по вовлечению АФК в систему сигнализации растений также подтверждают участие Са2+ в этих процессах [11—13].
Одним из важных источников генерации АФК в растениях является НАДФН-оксидазная ферментная система, локализованная на плазматической мембране клетки. Ингибирование активности НАДФН-оксидазы ведет не только к уменьшению генерации АФК, но и к торможению образования инфекционных нитей при симбиотических взаимоотношениях люцерны и 8тогк11оЫит твШоИ [14, 15]. Необходимо отметить, что усиление Са2+-сиг-нала происходит в том числе и за счет его взаимодействия с различными белками, которые после этого способны осуществлять ионный транспорт, функциональные, регуляторные и другие функции, поддерживать определенный уровень кальция в структурах и органеллах клетки.
С ферментом НАДФН-оксидазой (КФ 1.6.3.1) связывают, по крайней мере, два звена в метаболизме: генерацию АФК и потоки Са2+ [16]. Предполагается, что АФК и Са2+ являются основными сигнальными элементами в механизме регуляции активности мембранной НАДФН-оксидазы у растений [17]. НАДФН-оксидаза растений локализована на плазмалемме клеток корня и активируется при действии на растение абиотических и биотических стрессоров [18]. Образовавшиеся в результате активации этого фермента АФК защищают растение от патогенов путем участия в реакции сверхчувствительности клеток, системной приобретенной и индуцированной устойчивости, в укреплении клеточной стенки как механического барьера на пути инфекции [19]. Роль АФК при му-туалистических взаимодействиях неоднозначна: с одной стороны, они способствуют развитию бобо-во-ризобиального симбиоза; с другой — выполняют защитную роль как сигнальные и цитотоксиче-ские соединения [20].
В отличие от патогенного воздействия на растения, роль НАДФН-оксидазы и связанного с ее функциональной активностью кальция в мутуа-листических взаимодействиях до конца не ясна. В частности, нерешенным остается вопрос о механизмах регуляции НАДФН-оксидазы растений. Как уже отмечалось, важную роль в этом механизме может играть Са2+ [16]. Этим растительная НАДФН-оксидаза отличается от животной, поскольку содержит на цитозольном N-терминаль-ном участке Са2+-связывающие мотивы (EF-ру-ка) [17]. Это обеспечивает непосредственное стимулирование активности фермента с помощью ионов кальция, выход которых из внеклеточного пространства в цитоплазму инициируется экзогенными и эндогенными факторами.
Цель работы — изучение влияния ионов Са2+ на функциональную активность НАДФН-оксидазы в корнях этиолированных проростков гороха и влияние клубеньковых бактерий на этот процесс.
МЕТОДИКА
Объектом исследований служили проростки гороха посевного (Pisum sativum L.), сорт Ямальский, выращенные в пластмассовых кюветах на влажной фильтровальной бумаге при 22°С. Для поддержания заданной температуры с точностью до ±0.5 °С использовали электрический термостат с водяной рубашкой ЗЦ-1125М (Россия). Перед замачиванием семена трижды промывали теплой проточной водой с мылом и обеззараживали 3%-ным раствором Н2О2 в течение 15 мин. Затем семена заливали дистиллированной водой (60°С) и помещали в термостат для набухания при 22°С на 3—4 ч. После этого семена перекладывали в кювету на влажную фильтровальную бумагу и проращивали при 22°С в течение 48 ч. Полученные таким образом исходные растения использовали для дальнейшей работы, для чего выбирали проростки с одинаковыми размерами корней. В экспериментах использовали 48-часовые проростки гороха, которые в зависимости от варианта опыта инокулировали клубеньковыми бактериями Rhizobium leguminosarum bv viceae, эффективного производственного штамма 1060 в концентрации 2 х 108 кл./мл (1 мл/проросток). Штамм получен из коллекции Всероссийского научно-исследовательского института сельскохозяйственной микробиологии РАСХН (Санкт-Петербург, Россия). Контрольным вариантом служили неинокулированные ризобиями проростки, выращенные на дистиллированной воде.
Проростки инкубировали на растворах изучаемых соединений в течение 5, 10, 20 и 30 мин. В исследованиях применяли экзогенный кальций (100 мкМ CaCl2), а интенсивность потока в клетках эндогенного кальция изменяли путем дей-
238
ГЛЯНЬКО, ИЩЕНКО
НАДФН-оксидаза, % 250
200 150 100 50
0
10
20
30 мин
Рис. 1. Динамика активности НАДФН-оксидазы корней проростков гороха на фоне экзогенного источника кальция. I — контроль, II — 100 мкМ СаС12. На рис. 1, 2 и 3: * — достоверно при Р> 0.95, ** — при Р> 0.99.
ствия на проростки активатора кальциевых каналов амиодарона ("Sigma-Aldrich", США) в концентрации 300 мкМ и блокатора кальциевых каналов хлорида лантана в концентрации 400 мкМ. В качестве хелатора ионов кальция использовали 100 мкМ раствор этиленгликоль тетрауксусной кислоты (ЭГТА) ("Sigma-Aldrich", США).
Активность НАДФН-оксидазы измеряли в микросомальной клеточной фракции корней, полученной методом дифференциального центрифугирования. Для этого корни отмывали дистиллированной водой, взвешивали и гомогенизировали в предварительно охлажденной ступке в буферном растворе (50 мМ HEPES-KOH, рН 7.8), содержащем 250 мМ сахарозу и 0.1 мМ ЭДТА [23]. Далее гомогенат фильтровали через капроновую ткань и центрифугировали при 600 g в течение 15 мин для осаждения тяжел
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.