РАДИАЦИОННАЯ БИОЛОГИЯ. РАДИОЭКОЛОГИЯ, 2013, том 53, № 6, с. 562-566
= КЛЕТОЧНАЯ РАДИОБИОЛОГИЯ
УДК [57+61]::539.1.04
ВЛИЯНИЕ рН СРЕДЫ ИНКУБАЦИИ НА ПОВРЕЖДЕНИЕ ПЛАЗМАТИЧЕСКИХ МЕМБРАН МАКРОФАГОВ © 2013 г. С. К. Пирутин12*, В. Б. Туровецкий1, А. Б. Дружко2, Ю. Б. Кудряшов1
1 Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, Биологический факультет, Москва 2 Институт экспериментальной и теоретической биофизики РАН, Пущино
В работе показано рН-зависимое изменение чувствительности мембран перитонеальнах мышиных макрофагов к повреждающему действию УФ-излучения. Эта зависимость обсуждается с точки зрения модификации устойчивости липидного бислоя мембраны, при различных значениях рН, к действию АФК и процессу ПОЛ. При дополнительном усилении ПОЛ с помощью железо-аскорбатной системы также наблюдается рН-зависимый характер повреждения мембран. Усиление ПОЛ при повышении температуры среды инкубации клеток до 37°С не меняет рН-зависимую картину повреждения последних. Снижение рН среды инкубации не уменьшает повреждение клеток, индуцированное Н2О2, а повышение рН увеличивает повреждение последних.
УФ-излучение, повреждение мембран, перитонеальные макрофаги, Н2О2, перекисное окисление липидов, рН.
БО1: 10.7868/8086980311306012Х
При действии различных неблагоприятных факторов на клетки одной из главных мишеней этого воздействия являются их плазматические мембраны [1, 2]. Часто такие воздействия приводят к нарушению целостности последних и гибели клеток [3—5]. Важная роль в этих событиях отводится активным формам кислорода (АФК), приводящим к запуску процесса перекисного окисления липидов (ПОЛ), в результате которого происходит нарушение целостности липидного бислоя мембраны [6, 7]. В условиях все усиливающегося антропогенного загрязнения биосферы важной задачей является поиск простых и доступных средств модификации (и главным образом устойчивости) организмов на клеточном уровне к действию повреждающих факторов различной природы. Решение подобной задачи важно и для медицины, в связи с появлением новых препаратов с сильными побочными эффектами.
Поскольку, как уже указано выше, значительную роль в повреждении клеток играет процесс ПОЛ, удобным модельным воздействием в таких исследованиях может выступать УФ-излучение. Выраженной биологической активностью обладает средневолновое УФ-излучение (УФБ, 280— 320 нм) [8, 9]. Для клеточной модели удобно использовать клетки, обладающие значительной функциональной активностью. Такими клетками являются макрофаги [10, 11]. В качестве еще од-
* Адресат для корреспонденции: 119899 Москва, Воробьевы Горы, МГУ, Биологический факультет, кафедра биофизики; тел.: 8(495) 939-51-50; e-mail: pirutin@yandex.ru.
ного повреждающего фактора часто используют перекись водорода. Последняя является одной из наиболее долгоживущих и реакционноспособных АФК и играет значительную роль в повреждении плазматических мембран [12, 13].
Важным фактором, влияющим на гомеостаз как организма в целом, так и отдельных клеток, является рН вне и внутри клеточной среды [14]. Также известно, что водородный показатель влияет на структурно-функциональное состояние клеток и их устойчивость к ряду повреждающих факторов [14, 15].
В связи с вышеизложенным цель настоящей работы заключалась в изучении повреждающего действия УФ-излучения на перитонеальные мышиные макрофаги, модификации этого повреждения с помощью изменения рН инкубационной среды, а также вклада перекиси водорода и процесса ПОЛ в повреждение клеток.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДИКА
Объектом исследования служили перитоне-альные макрофаги беспородных белых мышей. Для их получения животных забивали с помощью цервикальной дислокации, вводили в брюшную полость 2 мл раствора Хенкса (содержавшего 10 ммоль/л HEPES, рН 7.2; Serva) и через несколько минут извлекали перитонеальную жидкость, обогащенную макрофагами. Подготовку препаратов клеток на покровных стеклах проводили, как описано ранее [16]. В работе использовали люминесцентный микроскоп ЛЮМАМ ИЗ
ВЛИЯНИЕ рН СРЕДЫ ИНКУБАЦИИ НА ПОВРЕЖДЕНИЕ
563
(ЛОМО, г. Ленинград). Возбуждение флуоресценции препаратов осуществляли с использованием галогенной лампы накаливания КГМ 9-70 и комбинации стеклянных светофильтров ФС 1-4 и СЗС 21-2. Определение целостности плазматической мембраны макрофагов осуществляли с помощью перекрестной окраски двумя флуоресцентными зондами, бромистым этидием и флуо-ресцеиндиацетатом, в конечной концентрации 5 мкг/мл ("Serva", Германия) [17]. Клетки с неповрежденной мембраной определяли по зеленой флуоресценции флуоресцеина. При повреждении мембраны в клетки проникает этидиум бромид и, связываясь с ядерной ДНК, приводит к красному окрашиванию клеток [18]. При этом повреждение плазматической мембраны сопровождается вытеканием флуоресцеина. Клетки с флуорохромами инкубировали в течение 10 мин, отмывали от не связавшегося красителя и проводили подсчет числа поврежденных клеток. В качестве источника излучения использовали лабораторный спектральный облучатель ЛОС-2 (СКБ БП АН СССР, Пущино). Облучение клеток проводили на специально изготовленном стенде, с использованием интерференционных светофильтров с максимумами пропускания при X = 306 нм в комбинации со стеклянным светофильтром УФС-5, для дополнительного подавления красной компоненты. Интенсивность и доза УФ-излучения составляла 1.5 мВт/см2 и 8 Дж/см2 соответственно. Для измерения интенсивности падающего на объект излучения использовали УФ-радиометр "Аргус-03" (ГНМЦ ВНИИ ОФИ).
Смену стандартной среды (рН 7.2) на модифицированную (с измененным рН) производили за 20 мин до начала воздействия.
В работе использовали 3%-ный раствор перекиси водорода в конечной концентрации 10 ммоль/л. Также в работе для интенсификации процесса ПОЛ в мембранах макрофагов применяли железо-аскарбатную систему по стандартной методике [7]. Для этого использовали FeSO4 и аскорбат (SIGMA, США) в конечных концентрациях 10 и 30 ммоль/л соответственно. Для блокирования каталазы в клетках использовали специфический ингибитор последней — 3-аминотриа-зол (3-АТ) ("SIGMA", США) [19, 20] в конечной концентрации 10 ммоль/л, который вводили в среду инкубации за 5 мин до начала облучения.
Эксперименты проводили при температурах 22 и 37°C. Полученные данные представлены в виде средних арифметических значений исследованных параметров и их среднеквадратических ошибок. Статистическая обработка результатов выполнена с использованием критерия Стьюден-та. Различия между средними арифметическими значениями параметров считали достоверными прир < 0.05.
Количество поврежденных клеток, % 80
70 60 50 40 30 20 10
□ 3
6.3 7.2 8.4
Значение рН среды инкубации клеток
Рис. 1. Модификация повреждающего действия УФ-излучения на макрофаги при изменении рН среды инкубации.
Данные представлены в виде относительного содержания поврежденных клеток в популяции макрофагов (в %) после окончания воздействия УФ-излуче-ния (А,тах = 306 нм) в дозе 8 Дж/см2 при различных рН среды их инкубации: рН 6.3 — (1), рН 7.2 — (2) и рН 8.4 - (3).
РЕЗУЛЬТАТЫ
Ранее мы наблюдали эффект модификации фоточувствительности клеточных мембран в зависимости от рН среды инкубации [16], однако до конца причина такого эффекта не была ясна. В новой серии экспериментов, при отличных от предыдущих условиях, получены данные, выявившие эффект изменения устойчивости плазматических мембран к действию УФ-излучения при различных рН среды их инкубации. Как видно из рис. 1, повышение рН среды инкубации от 7.2 до 8.4 ед. приводит к увеличению числа поврежденных клеток в популяции макрофагов, подвергнутых действию УФ-излучения в дозе 8 Дж/см2 (Хтах = 306 нм). Снижение же рН среды инкубации до 6.3 приводит к существенному снижению числа поврежденных излучением клеток.
Как отмечалось выше, важная роль в УФ-ин-дуцированном повреждении плазматических мембран принадлежит АФК (в частности Н2О2) и процессу ПОЛ. Также известно, что интенсификация процесса ПОЛ происходит при увеличении температуры [7]. Особо отмечается интервал температур от 5 до 40°С, связанный со структурными перестройками в липидном матриксе мембран [21]. Для изучения вклада АФК и процесса ПОЛ в УФ-индуцированное повреждение мембран проведен следующий эксперимент. Макрофаги при температурах среды инкубации 22 и 37°С в присутствии или отсутствии в среде блокатора ката-лазы 3-АТ подверглись действию УФ-излучения в дозе 8 Дж/см2. Из рис. 2 видно, что воздействие УФ-излучения при температуре среды инкубации 22°С в присутствии 3-АТ (в концентрации
0
Количество поврежденных клеток, %
90 □ 1 3-АТ
80 - □ 2
70 ^ □ 3
60 50 40 30 20 10
22
37
Температура,°С
Количество поврежденных клеток, % 70
60 50 40 30 20 10
6.3 7.2 8.4
Значение рН среды инкубации клеток
Рис. 2. Повреждающее действие УФ-излучения на макрофаги, находящиеся в стандартной и модифицированных средах инкубации.
Данные представлены в виде относительного содержания поврежденных клеток в популяции макрофагов (в %) после окончания воздействия УФ-излуче-ния (А,тах = 306 нм) в дозе 8 Дж/см2: в среде инкубации при 22°С — без добавления 3-АТ (1) или с добавлением (2); и при 37°С без добавления 3-АТ (3).
Рис. 4. Повреждающее действие перекиси водорода и железо-аскорбатной системы на мембраны перито-неальных макрофагов.
Данные представлены в виде относительного содержания поврежденных клеток в популяции макрофагов (в %) после окончания их часовой инкубации в присутствии перекиси водорода при температуре среды 22°С: без железо-аскорбата (1) и в присутствии последнего (2).
10 ммоль/л) приводит к достоверному увеличению количества поврежденных клеток (столбик 2) по сравнению с таковым при отсутствии последнего (столбик 1). В то же время повышение температуры среды инкубации до 37°С сопровождается еще более выраженным возрастанием чувствительности макрофагов к повреждающему действию УФ-излучения.
Количество поврежденных клеток, %
80 70 60 50 40 30 20 10
□ 1
6.3 7.2 8.4
Значение рН среды инкубации клеток
Рис. 3. Повреждающее действие железо-аскорбатной системы на мембраны перитонеальных макрофагов. Данные представлены в виде
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.