научная статья по теме ВЛИЯНИЕ РН СРЕДЫ ИНКУБАЦИИ НА ПОВРЕЖДЕНИЕ ПЛАЗМАТИЧЕСКИХ МЕМБРАН МАКРОФАГОВ Биология

Текст научной статьи на тему «ВЛИЯНИЕ РН СРЕДЫ ИНКУБАЦИИ НА ПОВРЕЖДЕНИЕ ПЛАЗМАТИЧЕСКИХ МЕМБРАН МАКРОФАГОВ»

РАДИАЦИОННАЯ БИОЛОГИЯ. РАДИОЭКОЛОГИЯ, 2013, том 53, № 6, с. 562-566

= КЛЕТОЧНАЯ РАДИОБИОЛОГИЯ

УДК [57+61]::539.1.04

ВЛИЯНИЕ рН СРЕДЫ ИНКУБАЦИИ НА ПОВРЕЖДЕНИЕ ПЛАЗМАТИЧЕСКИХ МЕМБРАН МАКРОФАГОВ © 2013 г. С. К. Пирутин12*, В. Б. Туровецкий1, А. Б. Дружко2, Ю. Б. Кудряшов1

1 Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, Биологический факультет, Москва 2 Институт экспериментальной и теоретической биофизики РАН, Пущино

В работе показано рН-зависимое изменение чувствительности мембран перитонеальнах мышиных макрофагов к повреждающему действию УФ-излучения. Эта зависимость обсуждается с точки зрения модификации устойчивости липидного бислоя мембраны, при различных значениях рН, к действию АФК и процессу ПОЛ. При дополнительном усилении ПОЛ с помощью железо-аскорбатной системы также наблюдается рН-зависимый характер повреждения мембран. Усиление ПОЛ при повышении температуры среды инкубации клеток до 37°С не меняет рН-зависимую картину повреждения последних. Снижение рН среды инкубации не уменьшает повреждение клеток, индуцированное Н2О2, а повышение рН увеличивает повреждение последних.

УФ-излучение, повреждение мембран, перитонеальные макрофаги, Н2О2, перекисное окисление липидов, рН.

БО1: 10.7868/8086980311306012Х

При действии различных неблагоприятных факторов на клетки одной из главных мишеней этого воздействия являются их плазматические мембраны [1, 2]. Часто такие воздействия приводят к нарушению целостности последних и гибели клеток [3—5]. Важная роль в этих событиях отводится активным формам кислорода (АФК), приводящим к запуску процесса перекисного окисления липидов (ПОЛ), в результате которого происходит нарушение целостности липидного бислоя мембраны [6, 7]. В условиях все усиливающегося антропогенного загрязнения биосферы важной задачей является поиск простых и доступных средств модификации (и главным образом устойчивости) организмов на клеточном уровне к действию повреждающих факторов различной природы. Решение подобной задачи важно и для медицины, в связи с появлением новых препаратов с сильными побочными эффектами.

Поскольку, как уже указано выше, значительную роль в повреждении клеток играет процесс ПОЛ, удобным модельным воздействием в таких исследованиях может выступать УФ-излучение. Выраженной биологической активностью обладает средневолновое УФ-излучение (УФБ, 280— 320 нм) [8, 9]. Для клеточной модели удобно использовать клетки, обладающие значительной функциональной активностью. Такими клетками являются макрофаги [10, 11]. В качестве еще од-

* Адресат для корреспонденции: 119899 Москва, Воробьевы Горы, МГУ, Биологический факультет, кафедра биофизики; тел.: 8(495) 939-51-50; e-mail: pirutin@yandex.ru.

ного повреждающего фактора часто используют перекись водорода. Последняя является одной из наиболее долгоживущих и реакционноспособных АФК и играет значительную роль в повреждении плазматических мембран [12, 13].

Важным фактором, влияющим на гомеостаз как организма в целом, так и отдельных клеток, является рН вне и внутри клеточной среды [14]. Также известно, что водородный показатель влияет на структурно-функциональное состояние клеток и их устойчивость к ряду повреждающих факторов [14, 15].

В связи с вышеизложенным цель настоящей работы заключалась в изучении повреждающего действия УФ-излучения на перитонеальные мышиные макрофаги, модификации этого повреждения с помощью изменения рН инкубационной среды, а также вклада перекиси водорода и процесса ПОЛ в повреждение клеток.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДИКА

Объектом исследования служили перитоне-альные макрофаги беспородных белых мышей. Для их получения животных забивали с помощью цервикальной дислокации, вводили в брюшную полость 2 мл раствора Хенкса (содержавшего 10 ммоль/л HEPES, рН 7.2; Serva) и через несколько минут извлекали перитонеальную жидкость, обогащенную макрофагами. Подготовку препаратов клеток на покровных стеклах проводили, как описано ранее [16]. В работе использовали люминесцентный микроскоп ЛЮМАМ ИЗ

ВЛИЯНИЕ рН СРЕДЫ ИНКУБАЦИИ НА ПОВРЕЖДЕНИЕ

563

(ЛОМО, г. Ленинград). Возбуждение флуоресценции препаратов осуществляли с использованием галогенной лампы накаливания КГМ 9-70 и комбинации стеклянных светофильтров ФС 1-4 и СЗС 21-2. Определение целостности плазматической мембраны макрофагов осуществляли с помощью перекрестной окраски двумя флуоресцентными зондами, бромистым этидием и флуо-ресцеиндиацетатом, в конечной концентрации 5 мкг/мл ("Serva", Германия) [17]. Клетки с неповрежденной мембраной определяли по зеленой флуоресценции флуоресцеина. При повреждении мембраны в клетки проникает этидиум бромид и, связываясь с ядерной ДНК, приводит к красному окрашиванию клеток [18]. При этом повреждение плазматической мембраны сопровождается вытеканием флуоресцеина. Клетки с флуорохромами инкубировали в течение 10 мин, отмывали от не связавшегося красителя и проводили подсчет числа поврежденных клеток. В качестве источника излучения использовали лабораторный спектральный облучатель ЛОС-2 (СКБ БП АН СССР, Пущино). Облучение клеток проводили на специально изготовленном стенде, с использованием интерференционных светофильтров с максимумами пропускания при X = 306 нм в комбинации со стеклянным светофильтром УФС-5, для дополнительного подавления красной компоненты. Интенсивность и доза УФ-излучения составляла 1.5 мВт/см2 и 8 Дж/см2 соответственно. Для измерения интенсивности падающего на объект излучения использовали УФ-радиометр "Аргус-03" (ГНМЦ ВНИИ ОФИ).

Смену стандартной среды (рН 7.2) на модифицированную (с измененным рН) производили за 20 мин до начала воздействия.

В работе использовали 3%-ный раствор перекиси водорода в конечной концентрации 10 ммоль/л. Также в работе для интенсификации процесса ПОЛ в мембранах макрофагов применяли железо-аскарбатную систему по стандартной методике [7]. Для этого использовали FeSO4 и аскорбат (SIGMA, США) в конечных концентрациях 10 и 30 ммоль/л соответственно. Для блокирования каталазы в клетках использовали специфический ингибитор последней — 3-аминотриа-зол (3-АТ) ("SIGMA", США) [19, 20] в конечной концентрации 10 ммоль/л, который вводили в среду инкубации за 5 мин до начала облучения.

Эксперименты проводили при температурах 22 и 37°C. Полученные данные представлены в виде средних арифметических значений исследованных параметров и их среднеквадратических ошибок. Статистическая обработка результатов выполнена с использованием критерия Стьюден-та. Различия между средними арифметическими значениями параметров считали достоверными прир < 0.05.

Количество поврежденных клеток, % 80

70 60 50 40 30 20 10

□ 3

6.3 7.2 8.4

Значение рН среды инкубации клеток

Рис. 1. Модификация повреждающего действия УФ-излучения на макрофаги при изменении рН среды инкубации.

Данные представлены в виде относительного содержания поврежденных клеток в популяции макрофагов (в %) после окончания воздействия УФ-излуче-ния (А,тах = 306 нм) в дозе 8 Дж/см2 при различных рН среды их инкубации: рН 6.3 — (1), рН 7.2 — (2) и рН 8.4 - (3).

РЕЗУЛЬТАТЫ

Ранее мы наблюдали эффект модификации фоточувствительности клеточных мембран в зависимости от рН среды инкубации [16], однако до конца причина такого эффекта не была ясна. В новой серии экспериментов, при отличных от предыдущих условиях, получены данные, выявившие эффект изменения устойчивости плазматических мембран к действию УФ-излучения при различных рН среды их инкубации. Как видно из рис. 1, повышение рН среды инкубации от 7.2 до 8.4 ед. приводит к увеличению числа поврежденных клеток в популяции макрофагов, подвергнутых действию УФ-излучения в дозе 8 Дж/см2 (Хтах = 306 нм). Снижение же рН среды инкубации до 6.3 приводит к существенному снижению числа поврежденных излучением клеток.

Как отмечалось выше, важная роль в УФ-ин-дуцированном повреждении плазматических мембран принадлежит АФК (в частности Н2О2) и процессу ПОЛ. Также известно, что интенсификация процесса ПОЛ происходит при увеличении температуры [7]. Особо отмечается интервал температур от 5 до 40°С, связанный со структурными перестройками в липидном матриксе мембран [21]. Для изучения вклада АФК и процесса ПОЛ в УФ-индуцированное повреждение мембран проведен следующий эксперимент. Макрофаги при температурах среды инкубации 22 и 37°С в присутствии или отсутствии в среде блокатора ката-лазы 3-АТ подверглись действию УФ-излучения в дозе 8 Дж/см2. Из рис. 2 видно, что воздействие УФ-излучения при температуре среды инкубации 22°С в присутствии 3-АТ (в концентрации

0

Количество поврежденных клеток, %

90 □ 1 3-АТ

80 - □ 2

70 ^ □ 3

60 50 40 30 20 10

22

37

Температура,°С

Количество поврежденных клеток, % 70

60 50 40 30 20 10

6.3 7.2 8.4

Значение рН среды инкубации клеток

Рис. 2. Повреждающее действие УФ-излучения на макрофаги, находящиеся в стандартной и модифицированных средах инкубации.

Данные представлены в виде относительного содержания поврежденных клеток в популяции макрофагов (в %) после окончания воздействия УФ-излуче-ния (А,тах = 306 нм) в дозе 8 Дж/см2: в среде инкубации при 22°С — без добавления 3-АТ (1) или с добавлением (2); и при 37°С без добавления 3-АТ (3).

Рис. 4. Повреждающее действие перекиси водорода и железо-аскорбатной системы на мембраны перито-неальных макрофагов.

Данные представлены в виде относительного содержания поврежденных клеток в популяции макрофагов (в %) после окончания их часовой инкубации в присутствии перекиси водорода при температуре среды 22°С: без железо-аскорбата (1) и в присутствии последнего (2).

10 ммоль/л) приводит к достоверному увеличению количества поврежденных клеток (столбик 2) по сравнению с таковым при отсутствии последнего (столбик 1). В то же время повышение температуры среды инкубации до 37°С сопровождается еще более выраженным возрастанием чувствительности макрофагов к повреждающему действию УФ-излучения.

Количество поврежденных клеток, %

80 70 60 50 40 30 20 10

□ 1

6.3 7.2 8.4

Значение рН среды инкубации клеток

Рис. 3. Повреждающее действие железо-аскорбатной системы на мембраны перитонеальных макрофагов. Данные представлены в виде

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком