ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2007, том 54, № 1, с. 39-46
УДК 581.1
ВЛИЯНИЕ САХАРОВ НА РАЗВИТИЕ ОКИСЛИТЕЛЬНОГО СТРЕССА,
ВЫЗВАННОГО ГИПОТЕРМИЕЙ (НА ПРИМЕРЕ РАСТЕНИЙ КАРТОФЕЛЯ, ЭКСПРЕССИРУЮЩИХ ГЕН ИНВЕРТАЗЫ ДРОЖЖЕЙ)
© 2007 г. Ä. Н. Дерябин, М. С. Синькевич, И. М. Дубинина, Е. Ä. Бураханова, Т. И. Трунова
Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева Российской академии наук, Москва
Поступила в редакцию 04.04.2006 г.
Исследовали влияние Сахаров на развитие окислительного стресса, индуцированного гипотермией, в листьях растений двух генотипов картофеля (Solanum tuberosum L.), выращенных in vitro на MC-среде с 2%-ной сахарозой. В работе использовали нетрансформированные растения картофеля сорта Дезире и растения картофеля, экспрессирующие ген инвертазы дрожжей, находящийся под контролем пататинового промотора В33 класса I и содержащий последовательность лидерного пептида ингибитора протеиназы II для апопластной локализации фермента. При оптимальной для роста температуре 22°C экспрессия гена инвертазы дрожжей в листьях трансформантов привела к изменению углеводного метаболизма, которое выразилось в увеличении активности кислых форм инвертазы и внутриклеточного содержания сахаров (в основном, сахарозы, из-за ее ресинтеза). Экспозиция растений на свету в условиях длительной гипотермии (5°C, 6 суток) вызывала повышение в листьях активности всех форм инвертазы (в наибольшей степени кислой инвертазы) и накопление сахаров. В листьях картофеля, экспрессирующего ген инвертазы дрожжей, эти процессы происходили интенсивней. При гипотермии активность супероксиддисмутазы и интенсивность перекисного окисления липидов в листьях исследованных генотипов картофеля зависели от количества накопленных внутриклеточных сахаров. Сделан вывод о важной роли сахаров как стабилизаторов клеточных мембран и перехватчиков активных форм кислорода, тормозящих процессы свободнорадикального окисления биомолекул при развитии окислительного стресса, индуцированного гипотермией.
Solanum tuberosum - ген инвертазы дрожжей - гипотермия - перекисное окисление липидов - промотор пататина В33 - супероксиддисмутаза
ВВЕДЕНИЕ
Известно, что синтез сахарозы происходит в цитозоле клеток мезофилла листа на свету. Далее основной ее поток поступает из фотосинтези-рующих клеток в русло дальнего транспорта (флоэму) апопластным или симпластным путем. Часть сахарозы, распадаясь на глюкозу и фруктозу, используется в процессе метаболизма и, наконец, оставшаяся сахароза поступает во временное депо ассимилятов - вакуоль. Реакцию распада сахарозы до глюкозы и фруктозы катализирует фермент из класса гидролаз - инвертаза ф^-фруктофуранозид-фруктогидролаза, КФ 3.2.1.26) [1, 2]. В растениях она представлена тремя фор-
Сокращения: АФК - активные формы кислорода; МДА -малоновый диальдегид; ПОЛ - перекисное окисление липидов; СОД - супероксиддисмутаза.
Адрес для корреспонденции: Дерябин Александр Николаевич. 127276 Москва, Ботаническая ул., 35. Институт физиологии растений РАН. Факс: 007 (495) 977-80-18; электронная почта: trunova@ippras.ru.
мами, которые различаются по биохимическим характеристикам и субклеточной локализации. Инвертазы с оптимумом рН 4.5-5.0 находятся во внеклеточном пространстве - апопласте и связаны с клеточной стенкой, а также содержатся в виде растворимых белков в вакуоли. Инвертазы с оптимумами рН 7.0-7.8 представлены растворимыми цитоплазматическими белками [1].
Внеклеточная инвертаза является ключевым ферментом, катализирующим распад транспортной сахарозы [3, 4]. При поступлении сахарозы, предназначенной для дальнего транспорта, в апо-пласт в количестве, превосходящем производительность переносчиков флоэмных клеток, она дольше находится в контакте с внеклеточной кислой инвертазой и, следовательно, больший ее процент подвергается распаду. В результате возникает поток образующихся гексоз внутрь клеток, который приводит к удалению избытка сахарозы (в виде гексоз) из свободного пространства и к ее ресинтезу в клетках мезофилла [5].
Видимо, именно этот процесс наблюдали многие исследователи, работавшие с растениями,
трансформированными конструкциями, содержащими ген инвертазы дрожжей. Например, в трансформированных растениях арабидопсиса, томата и картофеля экспрессия чужеродного гена инвертазы дрожжей (апопластный вариант локализации фермента), находящегося под контролем конститутивного 35S-промотора CaMV, приводила к увеличению активности кислой инвертазы, нарушению экспорта сахарозы из клеток мезофилла во флоэму, ее накоплению в листьях и ингибированию процесса фотосинтеза по принципу обратной связи [6-8].
Исследования с растениями картофеля, у которых встроенный ген инвертазы дрожжей находится под контролем клубнеспецифичного промотора пататина В33 класса I (апопластный вариант локализации фермента), выявили увеличение активности кислой инвертазы и содержания сахаров в клубнях. При этом число клубней на одном растении было меньше, а их вес больше по сравнению с ^трансформированными растениями дикого типа [9]. Эти трансформанты имели сниженный порог концентрации (1-2%) сахарозы, необходимой для инициации клубнеобразования. Процесс образования клубней у них усиливался с увеличением содержания сахарозы в среде выращивания вплоть до 10%. В то же время для растений дикого типа оптимальная для инициации клубнеобразования концентрация сахарозы в среде выращивания составляла 8%, и ее дальнейшее увеличение резко тормозило этот процесс [10]. Наши исследования с трансформантом показали, что экспрессия гена инвертазы дрожжей привела к уменьшению числа и размеров структурных элементов хлоропластов, а после длительной гипотермии (5°С, 6 суток) - к усилению ксероморфизма клеток мезофилла [11]. Кроме того, листья трансформантов характеризовались высокой активностью всех форм инвертазы (особенно кислой формы), повышенным содержанием сахаров и имели большую устойчивость к действию низких температур, по сравнению с растениями, содержащими лишь маркерный ген GUS, находящийся под контролем 35S-промотора CaMV. Мы предположили, что повышенная холодоустойчивость трансформанта - результат влияния измененного соотношения сахаров в клетках мезофилла под действием чужеродной инвертазы [12, 13].
Давно известно, что внутриклеточное накопление низкомолекулярных растворимых сахаров в растениях происходит в ответ на абиотические стрессы, в том числе гипотермию [14, 15]. Накопление сахаров при действии гипотермии рассматривается исследователями как процесс, имеющий защитно-адаптационное значение [14, 16]. В последние годы получила признание гипотеза о неспецифической реакции растений на стрессоры, выражающейся в интенсификации внутрикле-
точных окислительных процессов с участием активных форм кислорода (АФК) и именуемой "окислительный стресс" [17, 18]. Накопление АФК - основа для инициирования цепных реакций перекисного окисления ненасыщенных ЖК фосфолипидов мембран [17]. Эти реакции приводят к накоплению одного из наиболее стабильных конечных продуктов - малонового диальде-гида (МДА). МДА используют для оценки интенсивности перекисного окисления липидов (ПОЛ) и в качестве одного из индикаторов окислительного стресса [19, 20]. Необходимо отметить, что в живой клетке поддерживается физиологически нормальный уровень свободнорадикальных процессов и ПОЛ, который регулируется сложной многокомпонентной системой защиты, состоящей из антиоксидантных ферментов и низкомолекулярных антиоксидантов [21]. Основная роль в элиминации АФК при действии стрессора принадлежит супероксиддисмутазе (СОД, КФ 1.15.1.1), которая ускоряет реакцию взаимодействия супероксидных анионов, приводящую к образованию молекулярного кислорода и пероксида водорода. Важно отметить, что супероксидный анион как первичный продукт восстановления молекулярного кислорода имеет относительно высокое время жизни и является источником других, более активных АФК, например, перекиси водорода [17]. Последняя в определенных условиях может служить источником гидроксильного радикала, обладающего высокой окислительной способностью и инициирующего цепные реакции ПОЛ. Удельная активность СОД, которая увеличивается в клетках при возрастании уровня супероксидных анионов [22], также служит одним из индикаторов окислительного стресса [20].
Предполагают, что сахара выполняют в клетке не только хорошо известные функции - метаболическую, энергетическую, криопротектор-ную, осморегуляторную [23], но могут служить и перехватчиками АФК. Как показано на модельной •ОН-генерирующей системе, протекторные свойства низкомолекулярных углеводов (сахарозы, фруктозы, глюкозы, маннозы, маннита) обусловлены их способностью перехватывать гид-роксильный радикал, тем самым предотвращая вызываемые этим радикалом повреждения биомолекул [24].
Основываясь на вышеизложенном, была сформулирована цель работы - изучить влияние сахаров на развитие окислительного стресса, индуцированного гипотермией, при использовании трансформанта картофеля с измененным углеводным метаболизмом.
МЕТОДЫ
Объектом исследования служили растения картофеля (Solanum tuberosum L., сорт Дезире),
экспрессирующие ген инвертазы дрожжей, находящийся под контролем пататинового промотора В33 класса I и содержащий последовательность лидерного пептида протеиназы II для апопласт-ной локализации фермента. Трансформанты также содержали маркерный ген устойчивости к ка-намицину nptII. Контролем служили ^трансформированные растения картофеля сорта Дезире (дикий тип). Растения были отобраны из коллекции клонов, полученных в результате совместной работы сотрудников Института молекулярной физиологии растений им. Макса Планка (Гольм, Германия) и Лаборатории роста и развития им. М.Х. Чайлахяна (ИФР РАН).
Растения размножали микрочеренкованием in vitro и выращивали в камере фитотрона ИФР РАН при 22°С и 16-часовом освещении люминесцентными лампами белого света (освещенность 4 клк) в течение 5 нед. в пробирочной культуре на агаризованной (0.7%) МС-среде, содержащей 2%-ную сахарозу и витамины (мг/л): тиамин - 0.5, пиридоксин - 0.5, мезоинозит - 60.0. Для изучения влияния гипотермии растения в возрасте 5 нед. поме
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.