ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2004, том 51, № 4, с. 534-540
УДК 581.143.6;581.2.07;581.175.1;632.938
ВЛИЯНИЕ САЛИЦИЛОВОЙ КИСЛОТЫ НА АКТИВНОСТЬ ПЕРОКСИДАЗЫ В СОВМЕСТНЫХ КУЛЬТУРАХ КАЛЛУСОВ ПШЕНИЦЫ С ВОЗБУДИТЕЛЕМ ТВЕРДОЙ ГОЛОВНИ Tilletia caries
© 2004 г. И. В. Максимов, Е. А. Черепанова, О. Б. Сурина, А. Р. Сахабутдинова
Институт биохимии и генетики Уфимского научного центра Российской академии наук, Уфа
Поступила в редакцию 24.04.2003 г.
Изучали влияние салициловой кислоты (СК) на пероксидазную активность в совместных культурах каллусов пшеницы Triticum aestivum L. с возбудителем твердой головни Tilletia caries. Показано, что гриб повышает активность пероксидазы в цитоплазматической фракции белка. СК снижает общую активность фермента, но при этом сохраняется активность пероксидазы с pI ~ 9.8 и проявляется анионная "хитин-специфичная" изопероксидаза с pI ~ 3.5. При инфицировании Tilletia caries обработанных СК каллусов в них происходит активация изоферментов с pI ~ 3.5, pI ~ 4.8 и pI ~ 7.5 и их выделение в среду культивирования. Высказывается предположение о способности СК регулировать активность изопероксидаз пшеницы при патогенезе и важной роли этого явления в защите растительных клеток от головневого гриба.
Triticum aestivum - Tilletia caries - каллусы - совместная культура - салициловая кислота - изопе-роксидазы
Салициловая кислота (СК) - одно из наиболее активно изучаемых в последнее время соединений. Известно, что СК индуцирует системно-приобретенную устойчивость, где немаловажное место занимают свободные формы кислорода [1, 2]. Кроме того, СК способна модулировать (повышать и ингибировать, в зависимости от концентрации Н202 (цит. по [3]) активность каталазы и пероксидазы [4, 5]. Предполагается, что эта модуляция связана с непосредственным взаимодействием СК с этими ферментами [6] и вовлечением ее в регуляцию их синтеза [5, 7].
Активация пероксидазы в ответ на стрессы является одним из ключевых процессов в формировании и развитии защитных реакций в растительных клетках [8]. Активность этого фермента в растении повышается при инфицировании фито-патогенами, обработке элиситорами [9], при поранении [10], при изменении температурного режима [11]. Высказываются предположения, что пероксидаза может участвовать в регуляции уровня и активности эндогенных и экзогенных сигнальных молекул в растении [12], например, через механизмы синтеза и деградации некото-
Сокращения: ИЭФ - изоэлектрофокусирование, СК - салициловая кислота, ФБ - фосфатный буфер. Адрес для корреспонденции: Максимов Игорь Владимирович. 45054 Уфа, пр. Октября, 69. Институт биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН. Электронная почта: phyto@anrb.ru
рых фитогормонов, перекисных соединений и соединений фенольной природы.
Поскольку ранее нами была показана потеря устойчивости растительных клеток в совместной культуре каллусов пшеницы и гриба Tilletia caries [13], мы предположили, что такая модель может быть перспективной для изучения индуцированной устойчивости растительных клеток к возбудителям головневых. В связи с этим, значительный интерес представляют данные, указывающие на возможность изменения активности отдельных изопероксидаз в растительных клетках культуры каллусов пшеницы под влиянием СК и фитопато-генного биотрофного гриба T. caries.
МЕТОДИКА
Растительный материал. Исследования проводили на каллусах мягкой пшеницы Triticum aestivum L. (сорт Жница). Каллусы выращивали при 26°C в темноте, на МС среде в присутствии или отсутствии 0.05 мМ СК. Часть каллусов спустя 5 сут инфицировали телиоспорами T. caries (ДС) Tul. (инфекционная нагрузка на каждый каллус составляла около 100 спор). Контролем служили необработанные СК и неинокулированные телиоспорами T. caries каллусы. Растительный материал для анализа активности пероксидазы после взвешивания фиксировали в жидком азоте через 3, 6, 10, 20 сут от момента инфицирования, по 4 каллуса на каждый срок опыта.
Для выделения цитоплазматической фракции пероксидазы каллусы пшеницы гомогенизировали в 0.01 М Ка-фосфатном буфере рН 6.0 (ФБ) (отношение масса навески: объем буфера - 1 : 3) и экстрагировали фермент при 4°С, в течение 1 ч. Экстракт центрифугировали 15 мин при 14000 об/мин на центрифуге типа 310Ь ("МесИатса ргесу7у]па", Польша). Супернатант отбирался для определения активности и изоэлектрического спектра ци-топлазматической пероксидазы.
Для выделения ионно-связанной фракции пероксидазы клеточные стенки каллусов пшеницы, после их 10-ти кратного отмывания 0.01 М ФБ содержащим 1% Тритон Х-100 ("1С№') (отношение масса навески: объем ФБ - 1 : 10), подвергались обработке 2 М КаС1 в 0.01 М ФБ (отношение масса навески: объем буфера - 1 : 1). Образцы центрифугировали 15 мин при 14000 об/мин на центрифуге типа 310 Ь ("МесИатса ргесу7у]па") и супернатант, был использован для определения активности.
Ковалентно-связанные с клеточными стенками изопероксидазы выделяли после отмывки от ионно-связанных фракций белка 0.01 М ФБ с применением 0.25% целлюлазы и 0.25% пектиназы ("Опо7ика", Япония).
Из культуральной агаровой среды, отобранной после 20 сут культивирования опытных культур, объемом 20 мл, пероксидазы выделяли с использованием 2 М КаС1 в 0.01 М ФБ и концентрировали. Все полученные образцы перед анализами подвергались диализу против 0.01 М ФБ.
Активность пероксидазы определяли микрометодом. Для этого, в лунки плоскодонных планшет для иммуноанализа ("ЫпЬго", Великобритания) добавляли по 0.075 мл ферментного образца, предварительно разбавленного в 50 объемах 0.01М ФБ и 0.025 мл раствора о-фенилендиамина в концентрации 0.5 мг/мл. После добавления 0.025 мл 0.016% Н2О2 развитие окраски останавливали через 2 мин добавлением 0.05 мл 4 N Н2БО4. Планшет сканировали при 492 нм на фотометре для иммунологических исследований производства Института биологического приборостроения (Россия).
Изоэлектрофокусирование (ИЭФ) белковых экстрактов проводили на приборе фирмы "Хийу-Каллур" (Эстония) с использованием 7% ПААГ и 2.5% изолитов ("1С№') с диапазоном изоэлектро-фокуссирования белков от р1 3.0 до 10.0. Аликво-ты супернатантов, содержащие как цитоплазма-тическую пероксидазу, так и пероксидазу клеточных стенок перед изоэлектрофокуссировкой дополнительно диализовали против дистиллированной воды. Наличие изопероксидаз в геле после ИЭФ проявляли с использованием 0.01% 3.3-диаминобензидина солянокислого ("СИетаро1", Чехия) в присутствии 0.001% перекиси водорода в
14
Время совместного культивирования, сут
Рис. 1. Изменение активности пероксидазы в цитоплазматической фракции белка в каллусах пшеницы под влиянием салициловой кислоты и инфицирования возбудителем твердой головни. 1 - контрольные каллусы, растущие на среде МС; 2 -инфицированные грибом T. caries каллусы, растущие на среде МС; 3 - каллусы, растущие на среде с 0.05 мМ СК; 4 - инфицированные грибом T. caries каллусы пшеницы, растущие на среде с 0.05 мМ СК.
0.1 М ФБ. Гель после отмывки от непрореагиро-вавшего субстрата, подвергали денситометриро-ванию на денситометре СИгошозсап 3 ("Yoyce-Loebl", Великобритания) при длине волны 405 нм. Компьютерные изображения гелей редактировали с помощью программы "Photoimpact 3.02". Изопероксидазы на денситограммах и фотографиях пронумерованы от анода к катоду. Исходно номера были введены для варианта опыта, содержащего максимальное количество пероксидаз (инфицированные T. caries каллусы, зафиксированные на 10-е сут совместного культивирования). Определение изоэлектрических точек изопероксидаз пшеницы проводили с использованием диагностических наборов белков с изоэлектрически-ми точками от pI ~ 3.5 до pI ~ 9.3 ("Sigma", США) (pI ~ 3.6 - амилоглюкозидаза из Aspergillus niger; pI ~ 4.6 - ингибитор трипсина сои; pI ~ 5.1 - лак-тоглобулин, pI ~ 6.85 - миоглобин кислый; pI ~ 7.35 миоглобин основной, pI ~ 8.3-8.6 - молочная дегидрогеназа, pI ~ 9.3 - трипсиноген).
Опыты проводили в 3-х биологических по-вторностях. Каждая белковая фракция анализировалась на пероксидазную активность и содержание белка не менее 4-х раз.
РЕЗУЛЬТАТЫ
На рис. 1 представлены данные по изменению активности пероксидазы в цитоплазматической фракции белка каллусов пшеницы под влиянием возбудителя твердой головни T. caries и СК. Вид-
- (а)
я н о
^ 4
- (в)
6 = S 8
/У
6 = S
л
14
J_I_I_I_L
14
1
14
6 = S
ГлгД
l/W
8 9 12
13 i
j_i_i_I_I_I_I_I_I_Li
15
M
pI
M
pI
чот-н сл vq oo <N со ^ vq со ^'l/S t^ oo oo oo cK
Рис. 2. Денситограммы ИЭФ цитоплазматической фракции пероксидазы выделенной из каллусов пшеницы (10 сут после инфицирования).
а - контрольные каллусы, растущие на среде MC; б - инфицированные грибом T. caries каллусы, растущие на среде MC; в - каллусы, растущие на среде с 0.05 мМ CK; г - инфицированные грибом T. caries каллусы пшеницы, растущие на среде с 0.05 мМ CK. S - точка нанесения образца на гель. М - маркерные белки.
но, что в каллусах растущих на среде с СК активность пероксидазы ниже контрольных на всем протяжении опыта. Инфицирование приводит к достоверному повышению цитоплазматической пероксидазной активности как в вариантах, растущих на среде МС, так и в вариантах с добавлением в питательную среду СК. Правда, в начальный срок опыта (3 сут) СК не влияла на активность пероксидазы, а у совместных культур, растущих на СК с фитопатогеном, происходило кратковременное снижение ее активности.
Как видно из представленных на рис. 2 денси-тограмм профилей изоперксидаз, инфицирование каллусов, а также их культивирование на среде с СК приводят к значительному изменению спектра изопероксидаз и их активности. Под влиянием фитопатогена в каллусах происходит повышение активности большинства изоформ этого фермента (рис. 26), что вполне согласуется с результатами по изменению активности общей цитоплазматической активности пероксидаз, представленной на рис 1. Как в инфицированных, так и в неинфи-цированных каллусах, растущих на питательной среде с добавлением СК (рис. 2в, 2г) активность
изопероксидаз проявлялась очень слабо. Однако в то же время часть изопероксидаз сохраняла свою активность. В совместных культурах каллусов п
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.