научная статья по теме ВЛИЯНИЕ САЛИЦИЛОВОЙ КИСЛОТЫ НА АЛЬТЕРНАТИВНЫЙ ПУТЬ ДЫХАНИЯ ЛЮПИНА ЖЕЛТОГО Биология

Текст научной статьи на тему «ВЛИЯНИЕ САЛИЦИЛОВОЙ КИСЛОТЫ НА АЛЬТЕРНАТИВНЫЙ ПУТЬ ДЫХАНИЯ ЛЮПИНА ЖЕЛТОГО»

ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2014, том 61, № 1, с. 43-52

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ

УДК 581.1

ВЛИЯНИЕ САЛИЦИЛОВОЙ КИСЛОТЫ НА АЛЬТЕРНАТИВНЫЙ ПУТЬ

ДЫХАНИЯ ЛЮПИНА ЖЕЛТОГО

© 2014 г. Н. С. Белозёрова, А. С. Баик, П. А. Буцанец, В. В. Кузнецов, А. Г. Шугаев, Е. С. Пожидаева

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН, Москва Поступила в редакцию 20.03.2013 г.

Исследовано влияние салициловой кислоты (СК) на интенсивность дыхания и активность альтернативного цианид-резистентного, чувствительного к салицилгидроксамовой кислоте пути окисления в изолированных этиолированных семядолях люпина желтого (Ьыртт ¡Швт Ь.) и выделенных из них митохондриях. После 12-часовой обработки 1 мМ СК в семядолях увеличивалась скорость поглощения кислорода преимущественно за счет активации цианид-резистентного дыхания (ЦРД) и альтернативного пути митохондриального окисления. Установлено, что геном люпина кодирует как минимум две изоформы альтернативной оксидазы (АО) - ЬиАОХ1 и ЬиАОХ2 с приблизительной мол. м. 35 кД. Эти белки постоянно присутствуют в митохондриях этиолированных семядолей люпина, но их уровень резко возрастал после обработки растения СК, вероятно, за счет увеличения содержания мРНК соответствующих генов. СК-индуцируемая экспрессия Аох-генов коррелировала с активацией ЦРД и увеличением максимальной активности АО, как в семядолях люпина, так и в выделенных из них митохондриях.

Ключевые слова: Ьыртт ¡Швт — митохондрии — альтернативная оксидаза — салициловая кислота

БОТ: 10.7868/80015330314010023

ВВЕДЕНИЕ

Салициловая кислота (СК) относится к фито-гормонам фенольной природы и оказывает регу-ляторное действие на многие физиологические процессы в растениях, включая термогенез [1], индукцию устойчивости при атаке патогенов [2, 3], воздействие неблагоприятных условий окружающей среды [4-6], прорастание семян, цветение и старение растений [6], синтез этилена при созревании фруктов [7]. Хорошо известна роль, которую играет СК в индукции процесса термоге-неза при цветении ароидных [1, 8]. Выделение тепла в клетках соцветий ароидных обусловлено диссипацией энергии в ЭТЦ митохондрий вследствие индукции альтернативной цианид-резистентной оксидазы (АО), которая шунтирует дыхательную цепь на уровне убихинона и переносит электроны к кислороду в обход двух (второго и

Сокращения: АО - альтернативная цианид-резистентная оксидаза, АП - альтернативный путь окисления, СК - салициловая кислота, СГК - салицилгидроксамовая кислота, ЦП -цитохромный путь окисления; ЦРД - цианид-резистентное дыхание.

Адрес для корреспонденции: Пожидаева Елена Станиславовна. 127276 Москва, Ботаническая ул., 35. Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН. Факс: +7 (499) 977-80-18; электронная почта: alenapoj@mail.ru

третьего) пунктов энергетического сопряжения. Показано, что экзогенная СК способна активировать цианид-резистентное дыхание (ЦРД) и в нетермогенных тканях растений [8—10]. Постулируется, что в этих тканях АО выполняет антиокси-дантную функцию, снижая степень восстановлен-ности переносчиков ЭТЦ, в первую очередь, пула убихинона, препятствуя избыточной генерации митохондриями активных форм кислорода (АФК), что особенно важно в условиях стресса [8].

В настоящее время имеется ряд работ, в которых исследовано действие СК на метаболизм митохондрий, а также влияние СК на активность АО и максимальную емкость альтернативного пути окисления (АП) в различных тканях и культуре клеток растений [10—12]. Показано, в частности, что в зависимости от концентрации СК может оказывать как разобщающее, так и ингибирую-щее действие на дыхание митохондрий и на процесс окислительного фосфорилирования [12]. Кроме того, была подтверждена способность СК индуцировать экспрессию генов, кодирующих АО (Аох-гены), в различных нетермогенных тканях растений [10, 12]. Существуют единичные работы, в которых прослеживается вся цепочка ре-гуляторного влияния СК от индукции генов Аох

до активации АП в митохондриях и тканях [9, 13]. Альтернативная оксидаза обнаружена у всех высших растений, у многих эукариотических водорослей, а также у некоторых грибов и простейших. Недавние исследования показали наличие гомологов АО у а-протеобактерий и некоторых видов животных [14]. У цианобактерий были идентифицированы гомологи терминальной ок-сидазы пластид, которая отдаленно родственна АО [15]. У растений АО кодируется подсемействами двух ядерных генов: Аох1 и Аох2 [16]. Число представителей каждого подсемейства зависит от вида растений. Гены Аох1, обнаруженные как у однодольных, так и у двудольных растений, экс-прессируются в ответ на стресс [16-18], в то время, как гены Аох2 обнаружены только у двудольных растений. Гены Аох2, как правило, экспрес-сируются конститутивно [16]. Установлено, что экспрессия генов Аох является тканеспецифич-ной и зависит от стадии онтогенеза [17, 19].

Целью данной работы было изучение влияния экзогенной СК на интенсивность дыхания и активность альтернативного пути окисления в семядолях люпина желтого и выделенных из них митохондриях. Также была изучена регуляция СК экспрессии генов Аох на уровне мРНК и белка.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объект исследований и постановка эксперимента. В работе были использованы этиолированные семядоли люпина желтого (Lupinus luteus L.) сорта Дружный. Обработку семядолей люпина желтого СК проводили по схеме, описанной в методике [20]. Семена люпина желтого проращивали в темноте на увлажненной фильтровальной бумаге в течение 3 суток. Затем от проростков люпина отделяли семядоли и инкубировали их на воде в течение 24 ч. После этого семядоли переносили на среды, содержащие различные концентрации СК, и инкубировали в течение 12 ч в темноте. Контрольные семядоли (без обработки СК) инкубировали также в течение 12 ч.

Определение скорости дыхания семядолей люпина желтого. Дыхательную активность определяли по поглощению кислорода, которое регистрировали полярографически, используя кислородный электрод конструкции Шольца и Островского [21]. Семядоли вносили в полярографическую ячейку, термостатируемую при 25°С. Для определения общей скорости дыхания (Кобщ), скорости цианид-резистентного (VKCN) и остаточного (Кост) дыхания применяли ингиби-торный анализ с использованием цианида калия (KCN, 4 мМ) и салицилгидроксамовой кислоты (СГК, 20 мМ). Оптимальные концентрации ингибиторов, достаточные для полного подавления соответствующих оксидаз, были определены в

предварительных опытах. Активность цитохром-ного пути митохондриального окисления (ЦП или Кцит) определяли по степени чувствительности дыхания ткани к цианиду, а максимальную активность альтернативного пути митохондри-ального окисления (АП или Кальт) определяли по степени чувствительности дыхания ткани к СГК в присутствии KCN. Остаточное дыхание ткани (Кост) измеряли по скорости поглощения кислорода тканью в присутствии KCN и СГК [22]. Вычисление уровня цианид-резистентного дыхания ткани (ЦРД) проводили по формуле:

ЦРД = (Vkcn/VU) х 100%.

Скорость поглощения кислорода тканью выражали в нг-атомах О2/(мин г сухого веса).

Выделение митохондрий и определение их скорости дыхания. Митохондрии выделяли из этиолированных семядолей люпина желтого методом дифференциального центрифугирования. К семядолям (5-7 г) добавляли буфер для гомогенизации: 0.5 М сахароза, 5 мМ ЭДТА, 40 мМ калий-фосфатный буфер (рН 8.0), 5 мМ ДТТ, 0.1% поликлар АТ, 0.1% БСА (соотношение вес/объем 1 : 4). Семядоли растирали пестиком в охлажденной ступке с небольшим количеством кварцевого песка в течение 2-3 мин. Гомогенат фильтровали через два слоя мираклоса и центрифугировали в течение 5 мин при 4000 g. Осадок удаляли, а супер-натант центрифугировали в течение 5 мин при 15000 g. Полученный осадок митохондрий ресус-пендировали в буфере отмывания, содержащем 0.4 М сахарозу, 50 мМ Mops (3-морфолинопро-пансульфоновая кислота) (рН 7.2), 5 мМ ЭДТА, 0.2% БСА, и центрифугировали в течение 5 мин при 4000 g. Осадок удаляли, а супернатант центрифугировали в течение 10 мин при 12000 g. Осадок митохондрий ресуспендировали в реакционном буфере, содержащим 0.3 М сахарозу, 50 мМ Mops (рН 7.2), 0.1% БСА, и сохраняли на льду. Там, где это указано особо, митохондрии подвергали дополнительной очистке в градиенте плотности сахарозы, согласно методике [23]. Скорость поглощения кислорода митохондриями определяли полярографически при 25°С в реакционном буфере, в который дополнительно вносили субстраты окисления (10 мМ малат и 10 мМ глутамат), 250 мкМ АДФ, а также 0.7-0.8 мг белка митохондрий. Активность ЦП окисления (Кцит) определяли по скорости чувствительного к 1 мМ KCN поглощения кислорода митохондриями. Активность АП окисления (Кальт) определяли по скорости чувствительного к 2 мМ СГК дыхания митохондрий в присутствии цианида. Для максимальной активации АО в реакционную среду добавляли 2 мМ ДТТ.

Следует отметить, что в присутствии ингибиторов основного (KCN) и альтернативного пути

Таблица 1. Праймеры, использованные в настоящей работе

№ Название гена Последовательность праймеров (5'-3') Температура отжига Исходный организм

1 LuUbqS GGGAGGAATGCAAATCTTTGTGAA 72°C Lupinus polyphyllus,

2 LuUbq_AS CACGGAGACGTAAAACAAGGTGAA X54381

3 Аоx_Р1 GARGCNKANAAYGARMGNATGCAYYT 70—54°C Arabidopsis thaliana

4 Аоx_Р2 GCYTCYTCYTCNARRTANCC (см. текст)

5 LuAox_S TTCCTCCTCGAAGTAGCCGACAA 65°C Lupinus luteus (см. текст)

6 LuAox_AS GGCGGAAAATGAAAGAATGCAT

(СГК) окисления скорость остаточного дыхания митохондрий была минимальна. Скорость поглощения кислорода митохондриями выражали в нмоль О^(мин мг белка).

Определение содержания белков АО люпина желтого с помощью вестерн-блот-анализа. Анализ суммарного содержания белков АО, а также их локализации в митохондриях люпина, проводили с помощью иммуноферментного анализа по стандартной методике [24] с использованием коммерческих поликлональных антител против белков АОХ1/АОХ2 ("Agrisera", Швеция). Для этого очищенные митохондрии [23] лизировали добавлением додецилсульфата натрия (ДДС) до конечной концентрации 1%. Затем лизат центрифугировали при 4°C в течение 30 мин

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком