ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2014, том 61, № 4, с. 555-564
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 581.1
ВЛИЯНИЕ САЛИЦИЛОВОЙ КИСЛОТЫ НА МЕТАБОЛИЧЕСКУЮ АКТИВНОСТЬ МИТОХОНДРИЙ РАСТЕНИЙ © 2014 г. А. Г. Шугаев, П. А. Буцанец, И. М. Андреев, Н. А. Шугаева
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН, Москва Поступила в редакцию 17.09.2013 г.
Изучено влияние салициловой кислоты (СК) на дыхание и генерацию мембранного потенциала на внутренней мембране митохондрий, выделенных из хранящегося корнеплода сахарной свеклы (Beta vulgaris L.) и семядолей этиолированных проростков люпина желтого (Lupinus luteus L.). При окислении малата в присутствии глутамата в митохондриях корнеплода СК в низких концентрациях (меньше 1.0 мМ) оказывала преимущественно разобщающее действие на дыхание, активируя скорость поглощения кислорода в состоянии 4 (в отсутствие АДФ) и не влияя на окисление в состоянии 3 (в присутствии АДФ). Напротив, в митохондриях семядолей аналогичные концентрации фитогормона ингибировали поглощение кислорода в присутствии АДФ и значительно слабее активировали окисление субстрата в состоянии 4. При этом 0.5 мМ СК снижала коэффициент дыхательного контроля по Чансу (ДК) на 25% (корнеплод) и на 35% (семядоли). При увеличении концентрации фитогормона (выше 1 мМ), независимо от объекта, окисление малата в состоянии 3 ингибиро-валось, а в состоянии 4 — активировалось. Величины ДК и АДФ/O при этом снижались на 50-60%. Действие высоких концентраций СК (2 мМ и выше) на окисление малата в состоянии 4 зависело от времени инкубации и носило двухфазный характер: первоначальная активация поглощения кислорода со временем сменялась ингибированием. Параллельное изучение действия СК на генерацию мембранного потенциала (Ду) при окислении малата в митохондриях корнеплода свеклы и семядолей люпина показало, что диссипация Ду наблюдалась вследствие разобщающего и ингибирующе-го действия фитогормона на дыхание. При этом величина диссипации Ду зависела от концентрации фитогормона, а также от времени его воздействия на митохондрии, особенно при высоких концентрациях. В целом была обнаружена корреляция между влиянием СК на дыхание митохондрий и на величину Ду сопрягающих мембран. Полученные результаты показывают, что ответная реакция митохондрий на СК определяется не только ее концентрацией, но также длительностью воздействия и, по-видимому, чувствительностью к фитогормону органелл, изолированных из различных растительных объектов.
Ключевые слова: Beta vulgaris — Lupinus luteus — митохондрии — салициловая кислота — окисление малата — мембранный потенциал
DOI: 10.7868/S0015330314040186
ВВЕДЕНИЕ
Салициловая кислота (СК) — фитогормон фе-нольной природы, оказывает регуляторное действие на многие физиологические процессы в растениях: термогенез при цветении ароидных,
Сокращения: АО — альтернативная CN-резистентная окси-даза; ДК — дыхательный контроль; ЗГК - запрограммированная гибель клеток; МДГ — малатдегидрогеназа; СК — салициловая кислота; РТР - проницаемость митохондриаль-ной мембраны (от permeability transition pore); Ay — электрический мембранный потенциал на внутренней мембране митохондрий; FCCP — trifluorocarbonylcyanide phenyl-hydrazone.
Адрес для корреспонденции: Шугаев Александр Григорьевич. 126276 Москва, Ботаническая ул., 35. Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН. Факс: 007 (499) 977-8018; электронная почта: ag_shugaev@ippras.ru
синтез этилена при созревании фруктов, формирование защитных реакций растений в ответ на атаку патогенов и действие неблагоприятных факторов окружающей среды (УФ, озона, экстремальной температуры, засоления и др.) [1—5]. Показано, что повышение уровня СК в клетках растений индуцирует синтез ряда защитных белков, а также оказывает существенное влияние на дыхательный метаболизм. В частности, эндогенная и экзогенная СК индуцируют синтез альтернативной цианид-резистентной оксидазы (АО) митохондрий, которая переносит электроны, поступающие от дыхательных субстратов, к кислороду в обход двух пунктов энергетического сопряжения в электрон-транспортной цепи (ЭТЦ) [6]. Индукция АО обеспечивает выделение тепла в
термогенных тканях растений. Постулируется, что в нетермогенных тканях АО выполняет защитную антиоксидантную роль, снижая уровень восстановленности переносчиков ЭТЦ и предотвращая избыточную генерацию активных форм кислорода (АФК) митохондриями в условиях абиотического стресса [7].
Несмотря на значительный прогресс, достигнутый в последнее время в выяснении путей передачи гормонального сигнала СК [8], некоторые стороны механизма ее действия остаются малоизученными. Это относится, в первую очередь, к выяснению возможного участия АФК (H2O2) в реализации регуляторного влияния СК на дыхание растений (например, экспрессии генов АО), а также в приобретении растениями системной устойчивости к инфекционным болезням (САР) и индукции запрограммированной гибели клеток (ЗГК) в ходе реакции сверхчувствительности [3, 5, 9-12]. В литературе имеются косвенные данные, свидетельствующие об участии митохондрий и генерируемых в них АФК в передаче регуляторного сигнала СК [3, 9]. В частности, показано, что индуцированная СК устойчивость табака к вирусу табачной мозаики оказалась чувствительна к салицилгидроксамовой кислоте, известному ингибитору АО [9]. В ряде работ показана близость эффектов, вызываемых экзогенной СК или Н2О2, например, в индукции ЗГК в клетках трансгенной культуры табака, характеризующихся низкой активностью АО [13]. Это позволило предположить, что митохондрии, а также образуемые в них АФК, могут быть важными посредниками в передаче сигнала СК не только при индукции термогенеза, но также формировании защитных реакций растений на действие неблагоприятных факторов окружающей среды [3, 4, 11, 14].
Вместе с тем в настоящее время в литературе имеются лишь единичные работы, посвященные выяснению влияния СК на метаболическую активность митохондрий растений, при этом полученные в них результаты оказались достаточно противоречивы. В частности, было показано, что инкубация клеточной культуры табака в присутствии низкой концентрации (20 мкМ) СК приводила к быстрому ингибированию поглощения кислорода и снижению внутриклеточного уровня АТФ [15]. Однако выделенные из этих клеток митохондрии оставались функционально активными, на основании чего авторы предположили, что действие СК на дыхание митохондрий в интакт-ных клетках проявляется иначе, чем на изолированных органеллах [15]. В обстоятельной работе Norman с соавт. [16] это противоречие частично удалось объяснить тем, что была показана способность клеток табака накапливать экзогенную СК. При этом концентрация внутриклеточной
СК могла превышать концентрацию экзогенной (добавленной) СК более чем в 10 раз. Кроме того, была обнаружена зависимость характера действия СК на метаболическую активность изолированных митохондрий от ее концентрации. Так, в низких концентрациях (ниже 100 мкМ) СК действовала как разобщитель окислительного фос-форилирования, увеличивая скорость окисления НАД-зависимых субстратов (малата + пирувата) в отсутствие АДФ (состояние 4). При увеличении концентрации СК (выше 1 мМ) она оказывала уже сильное ингибирующее действие на дыхание митохондрий, по-видимому, вследствие блокирования переноса электронов от начальных дегид-рогеназ ЭТЦ к пулу убихинона [16]. Сходным действием на дыхание обладали аналоги СК — бензойная и ацетилсалициловая кислоты. Авторы также отметили, что аналогичные результаты были получены при исследовании влияния СК на митохондрии, выделенные из других растительных объектов, а именно, проростков сои [16].
Тем не менее, имеющихся в литературе данных пока явно недостаточно для того, чтобы утверждать, что описанный выше характер действия СК на метаболизм митохондрий растений является универсальным. Так, в недавней работе, было обнаружено, что СК не увеличивала скорость окислении субстратов в состоянии 4 в митохондриях, выделенных из культуры клеток ежевики [17]. Кроме того, было показано, что СК и ее производное метилсалицилат оказывали разобщающее действие на дыхание митохондрий, выделенных из животных тканей (сердца крысы), в существенно более широком диапазоне концентраций (до 5 мМ) [18], чем на митохондрии растений [16]. Поэтому весьма вероятно, что характер влияния СК на метаболизм даже изолированных митохондрий может в сильной степени зависеть не только от концентрации фитогормона, но также от функционального состояния тех тканей, из которых были выделены органеллы, времени его действия и других параметров. Очевидно также, что предполагаемое разобщающее действие СК на дыхание должно быть подтверждено ее влиянием на величину мембранного потенциала митохондрий (Ду), одного из наиболее чувствительных параметров, характеризующих энергетический статус органелл. Однако до сих пор влияние СК на генерацию Ду на внутренней мембране митохондрий растений остается малоизученным. Так, в ранней работе Масй с соавт. [19] было показано, что 10 мМ СК вызывала диссипацию Ду в митохондриях проростков гороха, по мнению авторов, вследствие разобщения процесса окислительного фосфорилирования. Однако, как уже отмечалось выше, высокие концентрации СК способны существенно ингибировать активность ЭТЦ в митохондриях растений [16].
Влияние СК на параметры окислительного фосфорилирования при окислении малата + глутамата митохондриями корнеплода сахарной свеклы и семядолей люпина
Объект Вариант Состояние 3 Состояние 4 ДК АДФ/О
Митохондрии контроль 172 ± 38 49 ± 8 3.5 ± 1.3 2.9 ± 0.1
корнеплода свеклы 0.5 мМ СК 183 ± 27 70 ± 11 2.6 ± 0.4 2.4 ± 0.3
Митохондрии контроль 177 ± 14 43 ± 3 4.1 ± 0.4 2.8 ± 0.1
семядолей люпина 0.5 мМ СК 125 ± 16 49 ± 4 2.6 ± 0.4 2.6 ± 0.1
Примечание. Состав реакционной среды см. в разделе МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ. Дополнительно вносили 10 мМ малат, 18 мМ глутамат и 200 мкМ АДФ при окислении малата в состоянии 3. Скорости окисления субстратов выражены в нг-атом О2/(мин мг белка митохондрий).
Таким образом, целью данной работы было исследование действия СК на процесс о
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.