ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2011, том 58, № 4, с. 523-532
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ^^^^^^^^^^^^ СТАТЬИ
УДК 581.1
ВЛИЯНИЕ САЛИЦИЛОВОЙ КИСЛОТЫ НА СОДЕРЖАНИЕ БЕЛКОВ И ВКЛЮЧЕНИЕ В НИХ 14С-АМИНОКИСЛОТ В КОРНЯХ ГОРОХА © 2011 г. И. А. Тарчевский, В. Г. Яковлева, А. М. Егорова
Учреждение Российской академии наук Казанский институт биохимии и биофизики Казанского научного центра РАН, Казань Поступила в редакцию 29.10.2010 г.
Обработка корней гороха (Pisum sativum L.) салициловой кислотой (СК) приводила к изменению содержания в них ряда белков и включения в белки 14С-аминокислот. Анализ изменения этих показателей позволил разделить все белки корней на 4 группы: 1) самые многочисленные СК-независи-мые; 2) СК-зависимые с повысившимися содержанием и интенсивностью включения в них 14С-аминокислот; 3) СК-зависимые, у которых снизились и содержание, и интенсивность мечения; 4) СК-зависимые, содержание которых практически не изменялось (что ранее не позволяло относить их к СК-индуцируемым), но включение в которые 14С-аминокислот сильно затормаживалось. По всей вероятности, интенсивность протеолиза белков последней группы очень низка, что не приводит к заметному снижению их содержания даже при очень сильном ингибировании синтеза (включения в них 14С-аминокислот). С помощью современных протеомных методов были идентифицированы некоторые белки, относящиеся к СК-зависимым — фосфоглицеромутаза, S-аденозилмети-онинсинтаза 3, енолаза, халконизомераза, нуклеозиддифосфаткиназа 1 и тиоредоксин h.
Ключевые слова: Pisum sativum — салициловая кислота — протеомный анализ — 14С -аминокислоты — са-лицилат-индуцируемые белки
ВВЕДЕНИЕ
Выяснению особенностей действия на растения салициловой кислоты (СК) уделяется большое внимание в связи с тем, что этот стрессовый фитогормон является одним из ключевых факторов индукции иммунитета к патогенам у растений. В предыдущих работах с помощью протеом-ного анализа мы обнаружили, что под влиянием обработки СК происходило изменение содержания в корнях гороха около 3% белков [1, 2], в том числе 12 белков, которые ранее не относились к числу СК-зависимых. Наблюдалось появление отсутствовавших в контрольном варианте белков, одни из которых подавляют развитие патогенов, другие повышают устойчивость клеток растения. Происходило также СК-индуцированное снижение содержания и исчезновение некоторых характерных для контрольного варианта белков. Естественно было предположить, что это объясняется, в первую очередь, активацией синтеза этих белков в первом случае, и ингибированием — во втором.
Сокращения: СК — салициловая кислота; НДК 1 — нуклеозиддифосфаткиназа 1; ТФУ — трифторуксусная кислота; CHAPS — 3-[(3-cholamidopropyl) dimethylammonio]-1-pro-panesulfonate.
Адрес для корреспонденции: Яковлева Вера Гавриловна. 420111 Казань, ул. Лобачевского, 2/31, а/я № 30. Казанский институт биохимии и биофизики КНЦ РАН. Электронная почта: yakovleva@mail.knc.ru
Так как в растениях происходит постоянная регулируемая деградация белков и продолжительность "жизни" индивидуальных белков может существенно отличаться в зависимости от условий проведения опытов, то охарактеризованное нами СК-индуцированное изменение содержания различных белков [1, 2] могло зависеть не только от интенсивности их синтеза, но и деградации. Лишь в случае отсутствия деградации белков их содержание зависит только от интенсивности их синтеза. Теоретически же можно ожидать любое СК-индуцированное изменение соотношения интенсивности синтеза и протеолиза индивидуальных белков.
Помочь в решении вопроса о роли процессов синтеза и деградации белков в изменении их содержания могло, в определенной степени, использование такого показателя, как включение в белки 14С-аминокислот, характеризующее, прежде всего, интенсивность процессов синтеза. Необходимо отметить, что использование меченых аминокислот в протеомных исследованиях еще только начинается, но применение аминокислот, меченных по 15М [3, 4] и 358 [5], существенно помогло в исследовании особенностей синтеза ряда белков корней в первых двух случаях и листьев — во втором. Так как подобные исследования СК-индуцируемых белков корней растений ранее не проводились, то мы решили восполнить этот про-
бел и провести сопоставительный протеомный анализ влияния СК на содержание белков и включения в них 14С-аминокислот. В качестве объекта исследования были взяты корни гороха, так как протеомы корней изучены еще очень мало и считается [6], что исследования в этой области должны быть активизированы в связи с важной ролью корней в формировании устойчивости к абиогенным факторам и иммунитета — к биогенным.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Растительный материал. Проростки гороха (Pisum sativum L.) сорта Труженик выращивали на разбавленной в 4 раза водной среде Хогланда-Ар-нона при 25°С, освещали люминесцентными лампами с интенсивностью освещения 250 мкМ/(м2 с) при 16-часовом световом периоде. Проростки в возрасте 8 дней помещали на 42 ч в раствор СК (150 мкМ) в среде выращивания, затем проростки переносили на 30 ч в тот же раствор, но содержавший смесь 14С-аминокислот ("Amersham", США). Радиоактивность исходного раствора составляла 0.0228 МБк/мл. Контролем служили проростки, выращенные на той же среде без добавления СК, которые в параллельном опыте на 30 ч помещали в смесь 14С-аминокислот. Затем корни (пробы по 1 г) фиксировали жидким азотом.
Извлечение растворимых белков. После растирания корней в жидком азоте извлекали растворимые белки, используя Трис-HCl-буфер, pH 8.0, с добавлением 100 мМ ДТТ, 1 мМ ЭДТА и 1% коктейля ингибиторов протеаз при 4°С. Из го-могената брали по 20 мкл для измерения поглощения 14С-аминокислот. Поглощение 14С-смеси аминокислот проростками гороха и включение 14С-метки в белки определяли с помощью счетчика Дельта-300 ("Tracor Analytic", США). Пробы центрифугировали 10 мин при 14000 g, затем к су-пернатанту, содержавшему растворимые белки, приливали равный объем ледяного раствора 20% ТХУ в ацетоне. Белки выдерживали 1 ч при — 20°С. Осажденный белок промывали 3 раза охлажденным ацетоном с добавлением 50 мМ ДТТ, затем высушивали и хранили при -85°С. Белок растворяли в буфере, содержавшем 6 М мочевину, 2 М тиомочевину, 2% CHAPS (3-[(3-cholamidopropyl) dimethylammonio]-1-propanesulfonate), 2% Тритон X-100, 50 мМ ДТТ и 0.5% Bio-Lyte, рН 3—10.
Количественное определение белка. Пробы белка объемом 10 мкл доводили водой до 150 мкл и осаждали равным объемом охлажденной 20% ТХУ. Осадок растворяли в 0.1 М NaOH. Концентрацию белка определяли методом Lowry с соавт. [7] с использованием БСА в качестве стандарта.
Двумерное разделение растворимых белков.
Двумерный электрофорез проводили на приборах Protean IEF Cell, Protean II xi 2D Cell ("BioRad",
США) с использованием стрипов (полосок геля) длиной 11 см с иммобилизованным линейным градиентом рН 4—7. Пробы для нанесения на стрипы содержали равное количество белка (200 мкг). Белковые пробы вносили в буфер для ИЭФ (6 М мочевина, 2 М тиомочевина, 4% CHAPS, 50 мМ ДТТ, 0.5% Bio-Lyte (рН 3-10) и бромфеноловый синий). Активную регидрата-цию стрипов проводили в течение 12 ч при 50 В, ИЭФ — 10-12 ч при 20°С. Вначале проводили обессоливание образца при 250 В в течение 15 мин, затем линейно повышали напряжение до 8000 В за 3 ч, далее проводили собственно ИЭФ в течение 4—5 ч, чтобы общее количество вольт-часов составило 40 000. Перед началом разделения белков во втором направлении стрипы уравновешивали 15 мин в первом буфере (0.125 М Трис— HCl, 2% ДДС, 2% ДТТ, 30% глицерин, 6 М мочевина и следы бромфенолового синего), затем выдерживали 15 мин во втором уравновешивающем буфере, который содержал вместо ДТТ 2.5% йо-дацетамид. Разделение белков по молекулярным массам проводили с помощью 12.5% ДДС-ПАГЭ (20 мА на 1 гель). Пластины геля окрашивали Ку-масси G-250 с 2% ТХУ, что позволяло количественно оценить содержание белков. Сканирование гелей проводили на сканере EPSON 4990 Photo ("Seliko EPSON Corporation", Япония).
Для определения уровня мечения белков 14C-аминокислотами часть гелей высушивали и экспонировали в течение 2 мес. в контакте с рентгеновской пленкой ХВМ Retina (Германия), чувствительностью 1200 ед. с высокой контрастностью изображения. Окрашивание белков на гелях и степень почернения рентгеновской пленки в местах контакта с белками анализировали с помощью программы Phoretix 2D v 2004 Nonlinear Dynamics. Анализировали по шесть повторностей контрольного и опытного вариантов из двух независимых опытов.
СК-зависимыми белками считали те, у которых кратность соотношения величин содержания белков (по интенсивности окраски пятен на геле) в контрольном и опытном вариантах была не ниже 3, так же как и включения в них 14C-аминокис-лот (по степени почернения рентгеновской пленки). Полученные данные обрабатывали с использованием i-критерия Стьюдента (р < 0.05).
Идентификация белков с помощью масс-спек-трометрии. Содержащие белок кусочки геля размером 1 х 1 мм промывали 40% раствором ацето-нитрила в 0.1 М NH4HCO3 в течение 30 мин при 37°С для удаления красителя, затем высушивали и осуществляли гидролиз с использованием модифицированного трипсина в 0.05 М NH4HCO3 c концентрацией 15 мкг/мл. Гидролиз проводили в течение 12 ч при 37°С, реакцию останавливали добавлением 6 мкл 0.5% ТФУ в воде. Надгелевый
раствор использовали для получения MALDI-масс-спектров.
Масс-спектры были получены на тандемном MALDI-TOF-TOF масс-спектрометре Ultraflex II ("Bruker", Германия), оснащенном УФ лазером (Nd) в режиме положительных ионов с использованием рефлектрона и в тандемном режиме; точность измеренных моноизотопных масс в рефле-кто-моде после докалибровки по пикам автолиза трипсина составляла 0.007%, точность измеренных масс фрагментов составляла 1 Д. Идентификацию белков по "пептидному фингерпринту" и по спектрам фрагментации осуществляли при помощи программы Mascot (www.matrixscience.com). Поиск проводили в базе данных NCBI (National Centre for Biotechnology Information) среди белков растений с указанной точностью с учетом возможного окисления метионинов кислородом воздуха и возможной модификации цистеинов акр
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.