научная статья по теме ВЛИЯНИЕ СЕМЕННОЙ ЖИДКОСТИ НА ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ НЕЙТРОФИЛОВ, ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ Биология

Текст научной статьи на тему «ВЛИЯНИЕ СЕМЕННОЙ ЖИДКОСТИ НА ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ НЕЙТРОФИЛОВ, ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ»

ВЛИЯНИЕ СЕМЕННОЙ ЖИДКОСТИ НА ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ НЕЙТРОФИЛОВ, ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ

Савочкина А. Ю., Савельева А. А., Абрамовских О. С., Мезенцева Е. А., Никушкина К. В., Батурина И. Л.

ГБОУ ВПО ЮУГМУ Минздрава России; кафедра микробиологии, вирусологии, иммунологии и клинической лабораторной диагностики, Челябинск, Россия

Нейтрофилы обеспечивают первую линию защиты от патогенов. На слизистых оболочках женского репродуктивного тракта данные клетки наиболее представительны. Одним из защитных механизмов является образование внеклеточных сетей. Семенная жидкость с нормальной концентрацией ДНКазы способна разрушать данные структуры. В исследовании показана способность нейтрофилов периферической крови реагировать на клеточные элементы семенной жидкости путем образования внеклеточных сетей, а семенная плазма способствует их разрушению.

Ключевые слова: семенная жидкость, нейтрофильные внеклеточные ловушки

Актуальность. Нейтрофилы являются высокоактивными клетками врожденного иммунитета. [6] Свои эффекторные свойства они проявляют во время циркуляции в кровеносном русле за счет выделения высокоактивных веществ. При этоммассовость жизнеспособных нейтрофилов среди других иммунокомпетент-ных клеток в тканях и на слизистых оболочках указывает на их ключевую роль в данных локализациях [4]. Особое внимание привлекает недавно открытый защитный механизм, реализуемый нейтрофилами - способность к образованию внеклеточных сетей. Нейтрофильные внеклеточные ловушкки (НВЛ) представляют собой сетеподобные структуры с адсорбированными гранулярными и цитоплазматиче-скими белками [2]. Процесс образования НВЛ складывается в несколько этапов. Изначально неактивированный нейтрофил имеет дольчатую структуру ядра, что соответствует стадии нейтрофила с сегментированным ядром при индикации методом окрашивания акридиновым оранжевым [3]. После активации стимулами микробного или немикробного происхождения нейтрофил уплощается и образует многочисленные вакуоли, сегментированная ультраструктура ядра утрачивается. Ядерная мембрана растворяется, и деконденсирован-ный хроматин с гранулярным компонентом распределяется по всему объему клетки. При

микроскопии данный этап фиксируется как нейтрофил с недифференцированным ядром. Финальной стадией является экструзия содержимого клетки во внеклеточное пространство с образованием НВЛ. В норме у женщин в цер-викальном секрете содержится 6,47±0,40*109/л лейкоцитов [1], при этом нейтрофилы наиболее представительны, их количество превышает 95%. Возможно, адекватное функционирование данных клеток в цервикальном секрете является одним из определяющих факторов при прохождении сперматозоидов к месту оплодотворения. Поскольку НВЛ связывают с различными патологическими состояниями [5], интересно было бы оценить изменение функциональной активности нейтрофилов при взаимодействии с семенной жидкостью.

Материал и методы. Проведена оценка содержания морфологических форм нейтрофи-лов, в том числе количество внеклеточных ловушек, образованных нейтрофильными гранулоцитами, выделенными из периферической крови женщин в первую фазу менструального цикла, под действием семенной жидкости (СЖ) и ее фракций in vitro. Спер-миологический анализ включал стандартные показатели согласно рекомендациям ВОЗ. Отсутствие инфекций половых путей у мужчин подтверждалось методом ПЦР в реальном времени. Определена концентрация

382

Иммунорегуляция

ДНКазы СЖ методом иммуноферментного анализа набором DNase ELISA Kit, соответствующая средним значениям 3,92±0,06 нг/мл среди обследованных лиц. Отдельная группа представлена мужчинами, СЖ которых характеризуется нормативными показателями, но концентрация ДНКазы эякулята резко снижена 1,79±0,41 нг/мл (подгруппа 3, n=16). В исследовании использовалась СЖ, характеризующаяся нормозооспермией (подгруппа 1, n=17), вискозипатией (подгруппа 2, n=15). Кроме того часть СЖ подвергалась центрифугированию, в результате которого получали надосадочную жидкость (НЖ) и клеточные элементы эякулята (КЭЭ) в виде осадка. Осадок доводили физиологическим раствором до исходной концентрации сперматозоидов

в образце СЖ. Чистую фракцию нейтрофилов получали из периферической крови разделением клеточных элементов путем центрифугирования на двойном градиенте плотности фиколл-урографин. К взвеси нейтрофилов добавляли раздельно С^К, КЭЭ, Н^К, инкубировали in vitro. Параллельно проводился опыт с пирогеналом: нейтрофилы предварительно инкубировались с данным активатором, а затем добавляли СЖ, КЭЭ, НЖ. Далее определялось содержание морфологических форм нейтрофилов и количество НВЛ. В качестве контроля использовали взвесь клеток с физиологическим раствором. Данные анализировали с применением непараметрического метода U-критерий Манна-Уитни для расчета уровня значимости.

Таблица. Морфологические формы нейтрофилов (Нф), выделенных из периферической крови здоровых женщин, и число НВЛ

Группа Нф с сегментированным ядром,% Медиана (LQ - UQ) Нф с недифференцированным ядром,% Медиана (LQ - UQ) НВЛ, % Медиана (LQ - UQ)

Контроль 66 [52; 68,5] 18 [16; 29] 13 [2; 20]

Контроль+пирогенал 40 [30; 46] * 28 [17; 39,5] 16 [10; 33,5] *

Нф +СЖ Подгруппа

1 55 [40; 64] * 35 [26,5; 38,5] * 6 [4; 8,5]

2 64 [45;64] 32 [28; 32] * 6 [3; 6]

3 48 [42; 62] * 36 [27; 44] * 11 [8; 18] ***

Нф +СЖ + пирогенал 1 60 [46,5; 68] ** 26 [19,5; 28] 10 [4; 14] **

2 54 [44; 54] ** 38 [30; 38] **** 8 [0,1; 8] **

3 61 [44; 76] ** 20 [14; 36] 9 [2; 14] **,***

Нф+ КЭЭ 1 45 [19; 48] * 40 [27;42] * 16 [11;30] *,***

2 43 [35; 43] * 31 [26; 31] 28 [8; 28] *

3 33 [18;55] * 36 [26; 46] * 27 [16; 39] *, *****

Нф + КЭЭ+ пирогенал 1 44 [33; 57] * 36 [20; 38,5] * 18 [9; 22] ****

2 49 [34; 49] 29 [20; 29] 26 [21; 26]

3 55 [40; 70] * 27 [18; 37] 14,5 [10; 18]

Нф+ НЖ 1 61 [52; 68] ***** 17 [12,5; 35] ***, ***** 8 [2; 10,5] *****

2 54 [45; 54] 37 [24; 37] * 5 [1; 5]

3 65 [58; 76] 12 [8; 24] 14,5 [4; 26]

Нф+НЖ + пирогенал 1 64 [54,5; 74] *, ***** 22 [16; 29] 4 [1,05; 13] *, **, ******

2 60 [52; 60] * 34 [28; 34] 2 [1; 2] *

3 64 [52; 80] 20,5 [16; 36] 9 [0,1;29]

Примечание. Статистически значимые различия: "сравнение с группой контроля; **сравнение с группой контроль + пирогенал; *** сравнение с группой Нф+СЖ (подгруппа: норма); ****сравнение с группой Нф+СЖ+пирогенал (подгруппа: норма); ***** сравнение с группой Нф+КЭЭ (подгруппа: норма); ****** сравнение с группой Нф +КЭЭ + пирогенал (подгруппа: норма).

Результаты и обсуждение. Полученные результаты приведены в табл. Под действием СЖ как здоровых мужчин, так и мужчин со сниженной концентрацией ДНКазы эякулята при сравнении с группой контроля обнаружено снижение уровня нейтрофилов с сегментированным ядром, во всех исследуемых подгруппах фиксировалось увеличение уровня нейтрофилов с недифференцированным ядром. Данное обстоятельство указывает на активацию нейтрофилов по пути NETosis. При сравнении данных подгрупп между собой установлено статистически значимое увеличение уровня НВЛ в опыте, где нейтрофилы инкубировались с семенной жидкостью со сниженной концентрацией ДНКазы. В опыте с предварительной инкубацией нейтрофилов с пирогеналом обнаружено более высокое количество нейтрофилов с сегментированным ядром и меньшее число НВЛ по сравнению со значениями, полученными при работе с чистой фракцией нейтрофилов. КЭЭ действуют однонаправленно во всех изучаемых подгруппах: снижено число нейтрофилов с сегментированным ядром; увеличивается число ней-трофилов с недифференцированным ядром и увеличивается уровень НВЛ. При этом наибольшее число НВЛ обнаруживается при взаимодействии с КЭЭ, полученными из семенной жидкости со сниженной концентрацией ДНКазы. Под влиянием НЖ статистически значимых различий не обнаружено. Однако необходимо отметить, что опыте с предварительной инкубацией нейтрофилов с пироге-

налом под действием СЖ здоровых мужчин и СЖ, характеризующейся вискозипатией, значительно снижено число НВЛ. Это указывает, что в семенной плазме содержатся факторы, способствующие разрушению внеклеточных сетей. Семенная плазма с пониженным содержанием ДНКазы менее активна в отношении НВЛ. Таким образом, от концентрации активной ДНКазы семенной жидкости зависит уровень НВЛ.

Выводы: 1. Семенная плазма способствует разрушению НВЛ. 2. Эффективность разрушения НВЛ зависит от концентрации ДНКазы в эякуляте.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Долгушин И. И., Андреева Ю. С., Савочки-на А. Ю. Нейтрофильные ловушки и методы оценки функционального статуса нейтрофилов. М., 2009, 187 с.

2. Коротина О. Л., Генералов И. И. Иммунопатология, аллергология, инфектология 2012, 4, 23-32.

3. Патент № 2384844 Рос. Федерации Способ обнаружения нейтрофильных ловушек. И. И. Долгушин, Ю. С. Андреева (Российская Федерация). Заявл. 01.04.2008; опубл. 20.03.2010, Бюл. № 8, 7 с.

4. Baiton D. F. Williams Hematology, 5th ed. 1995, 753-765.

5. Hahn S., Giaglis St., Hoesli Ir., Hasler P. Neutrophil NETsin reproduction: frominfertilityto preeclampsia and the possibility of fetal loss. Fronties research topic, Netosis: at the intersection of cell biology, microbiology, and immunology 2012, 101-108.

6. Kumar V., Sharma A. International Immunophar-macology 2010, 10, 1325-1334.

EFFECT OF SEMEN FOR THE FUNCTIONAL CHARACTERISTICS OF NEUTROPHILS ISOLATED FROM PERIPHERAL BLOOD

Savochkina A. U., Saveleva A. A., Abramovskih O. S., Mezenceva E. A., Nikushkina K. V., Batuiina I. L.

South Ural State Medical University of the Russian Ministry of Health; Department of Microbiology, Virology, Immunology, and Clinical Laboratory Diagnostics, Chelyabinsk, Russia

Neutrophils provide the first line of defense against pathogens. On the mucous membranes of the female reproductive tract, these cells most personable. One of the defense mechanisms is the formation of extracellular networks. Semen with normal concentration of DNase is able to destroy these structures. The study demonstrated the ability of peripheral blood neutrophils respond to the cellular elements of seminal fluid through the formation of extracellular networks, and seminal plasma

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком