НЕЙРОХИМИЯ, 2011, том 28, № 4, с. 280-286
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ РАБОТЫ
УДК 612.816.7
ВЛИЯНИЕ СЕРОВОДОРОДА НА ПРОЦЕССЫ ЭКЗО- И ЭНДОЦИТОЗА СИНАПТИЧЕСКИХ ВЕЗИКУЛ В ДВИГАТЕЛЬНОМ НЕРВНОМ
ОКОНЧАНИИ ЛЯГУШКИ © 2011 г. Г. Ф. Ситдикова1*, А. В. Яковлев1, Ю. Г. Одношивкина2, А. Л. Зефиров2
1Казанский (Приволжский) федеральный университет, г. Казань 2Казанский государственный медицинский университет, г. Казань
В опытах на кожно-грудинной мышце лягушки с использованием внеклеточного микроэлектродного отведения и флуоресцентной микроскопии исследовали влияние донора сероводорода (Н2$) — гидросульфида натрия (№Н8) на динамику секреции медиатора и процессы экзо- и эндоцитоза си-наптических везикул в двигательном нервном окончании при длительном высокочастотном раздражении (20 Гц). В условиях одиночной стимуляции донор Н2$ вызывал увеличение амплитуды токов концевой пластинки (ТКП), а также замедлял развитие депрессии амплитуды ТКП при высокочастотной стимуляции (20 Гц, 3 мин). В опытах с использованием эндоцитозного флуоресцентного красителя FM 1-43 было показано, что при действии №Н$ происходит увеличение захвата красителя в синаптические везикулы во время стимуляции с частотой 20 Гц по сравнению с контролем. При этом захват красителя после окончания раздражения уменьшался. Кроме того, под действием №Н$ замедлялась выгрузка красителя из предварительно загруженных маркером нервных окончаний. На основании полученных данных можно предположить, что Н2$ ускоряет везикулярный цикл в двигательном нервном окончании, усиливая как процессы экзоцитоза, так и процессы быстрого эндоцитоза синаптических везикул во время высокочастотной стимуляции.
Ключевые слова: сероводород, секреция медиатора, двигательное нервное окончание, токи концевой пластинки, процессы экзо- и эндоцитоза, синаптические везикулы, ¥Ы 1-43.
Список сокращений: ТКП — токи концевой пластинки, цАМФ — циклический аденозинмо-нофосфат, H2S — сероводород, NaHS — гидросульфид натрия, НО — нервное окончание, SNARE — рецептор для белка SNAP.
Сероводород (H2S) — относится к новому классу посредников, которые наряду с монооксидом углерода и оксидом азота образуют группу газомедиаторов [1—4]. Эндогенно H2S образуется из L-цистеина, ферментами цистатион-у-лиазой, цистатионин-р-синтазой и меркаптосульфтранс-феразой, специфично экспрессирующимися в различных тканях [2, 5]. В мозге H2S участвует в индукции и поддержании долговременной по-тенциации [6], а в периферической нервной системе усиливает освобождение медиатора из двигательных нервных окончаний (НО) [7, 8]. Мишенями действия H2S в различных тканях являются АТФ-зависимые и кальций-активируемые калиевые каналы, потенциал-активируемые кальциевые каналы L- и T-типа [5, 9—11], аденилатцик-лазная система [12, 13].
В синаптических структурах ключевыми этапами секреции нейромедиатора являются про-
* Адресат для корреспонденции: 420008 г. Казань, ул. Кремлевская, д.18; тел.: (843)33-78-63; e-mail: guzel.sitdikova@ksu.ru.
цессы экзо- и эндоцитоза синаптических везикул [14, 15]. Процессы от экзоцитоза везикулы до приобретения ею повторной способности к экзо-цитозу получили название рециклирования, а постоянный кругооборот везикул в НО — везикулярным циклом [16]. Изменение динамики этих процессов лежит в основе пресинаптических форм пластичности, а нарушения везикулярного цикла наблюдаются при многих психических и неврологических заболеваниях [16, 17]. Данные о влиянии H2S на процессы экзо- и эндоцитоза в НО отсутствуют. Цель настоящей работы — исследование влияния донора H2S—NaHS на динамику секреции медиатора, процессы экзо- и эндоцито-за и рециклирования синаптических везикул в двигательном НО лягушки при длительной высокочастотной активности с использованием электрофизиологических и оптических (флуоресцентных) методов.
ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Эксперименты проводились на изолированных нервно-мышечных препаратах кожно-гру-динной мышцы озерных лягушек (Rana Ridibun-da) в осенне-зимний период. Мышцу растягивали и фиксировали в стеклянной ванночке объемом
100
75
П
К
Т
£
н S Ч С
50
25
Время, мин
Рис. 1. Влияние на динамику амплитуды токов концевой пластинки во время высокочастотного раздражения.
Показано изменение амплитуды токов концевой пластинки (ТКП) в течение 3 мин раздражения с частотой 20 Гц в контроле (■) и при действии (100 мкМ) (О). На вкладке представлена динамика амплитуды ТКП в течение пер-
вых 3 с раздражения.
5 мл в условиях непрерывной перфузии стандартным раствором Рингера для холоднокровных животных следующего состава (мМ): NaCl — 115.0, KCl - 2.5, CaCl2 - 1.8, HEPES - 5 (t = 20°С, рН 7.2-7.4). Для блокирования сокращений и потенциалов действия мышечных волокон использовали d-тубокурарин в концентрации 2-5 мкМ. В экспериментах использовали донор H2S - гидросульфид натрия (NaHS) в концентрации 100 мкМ (Sigma, США), который в водных растворах распадается с образованием газа - H2S [6, 18].
Электрофизиология. Для внеклеточной регистрации токов концевой пластинки (ТКП) использовали стеклянные микроэлектроды с диаметром кончика менее 1 мкм и сопротивлением 2-5 МОм, заполненные раствором NaCl (3 М). Для усиления и регистрации ТКП использовали автоматизированную систему, созданную на базе АЦП L-CARD 1250 и компьютера Pentium 4. Двигательный нерв раздражали прямоугольными импульсами сверхпороговой амплитуды с частотой 0.2 или 20 Гц в течение 3 мин.
Флуоресцентная микроскопия. В экспериментах использовали флуоресцентный краситель FM 1-43 (Biotium, США) в концентрации 2 мкМ. Краситель обратимо связывается с пресинапти-ческой мембраной и во время эндоцитоза оказывается внутри вновь образующихся синаптиче-ских везикул ("загружается" в НО) [19]. При за-
грузке красителя появляется свечение, отражающее скопления везикул, захвативших краситель [19, 20]. Для исследования процессов эндоцитоза использовали два протокола экспериментов. В первом — нервно-мышечный препарат инкубировали в растворе, содержащем маркер FM 1-43, во время высокочастотной стимуляции с частотой 20 Гц в течение 3 мин, во втором — в течение 7 мин после стимуляции (рис. 2а). Первый протокол позволял загрузить красителем везикулы рециклирующего пула, а второй — везикулы резервного пула [20—22]. После загрузки красителем препарат отмывали в течение 30 мин раствором Рингера и затем регистрировали свечение нервных терминалей.
Для анализа процессов экзоцитоза синаптиче-ские везикулы предварительно метили красителем (загружали краситель в НО). Для этого двигательный нерв раздражали в течение 3 мин с частотой 20 Гц. FM 1-43 присутствовал в растворе как во время стимуляции, так и в течение 7 мин после ее окончания. Такой протокол позволял загрузить красителем практически все везикулы, участвующие в секреции медиатора [20, 22, 23]. После этого повторно стимулировали двигательный нерв с частотой 20 Гц в течение 20 мин, анализируя снижение интенсивности флуоресценции НО ("выгрузка" красителя).
а 20 Гц
FM 1-43
20 Гц
FM 1-43
10 мин
10 мин
Конроль
NaHS
....... htiiriniiijnj
Конроль
NaHS
80
§60
g*40
о
(U
ц
о (U
р
о 20 ^
л
0
*
1
- 1
125
.
о
К
и ц
н
о
ц
о (U
р
о л
100
75
50
25
Конроль
NaHS
Конроль
NaHS
в
*
0
Рис. 2. Влияние NaHS на процессы эндоцитоза синаптических везикул во время и после высокочастотного раздражения. Загрузку флуоресцентного маркера FM1-43 проводили по двум протоколам: в течение (А) и после (Б) длительного высокочастотного раздражения с частотой 20 Гц. Представлены схемы экспериментов (а). Согласно первой схеме, нервно-мышечный препарат инкубировали в растворе, содержащем маркер FM 1-43, во время стимуляции с частотой 20 Гц в течение 3 мин (А), во втором — в течение 7 мин после стимуляции (Б). После загрузки красителем препарат отмывали в течение 30 мин раствором Рингера и регистрировали свечение нервных окончаний. Пунктирной линией показано время аппликации красителя, прямоугольником — высокочастотной стимуляции. Типичные картины флуоресценции терминалей (б, шкала — 5 мкм) и интенсивность флуоресценции (в) в контроле и при действии NaHS при загрузке нервной терминали красителем во время стимуляции (протокол А) или после окончания стимуляции (протокол Б). *p < 0.05.
Свечение НО наблюдали с помощью микроскопов МИКМЕД-2 ("ЛОМО", Санкт-Петербург) или AxioScope A1 ("Carl Zeiss", Германия) через водноиммерсионные объективы LUMPLFL 60х/0.9^А ("Olympus", USA) и/или Plan-Neoflu-ar 63x/0.9 ("Carl Zeiss", Германия). Все наблюдения проводили только на поверхностно-лежащих НО. Для регистрации картин флуоресценции использовали быстродействующие черно-белые видеокамеры WAT-902H ("Watec co., LTD", Япония) или AxioCam MRm ("Carl Zeiss", Германия). Оценивали среднюю интенсивность свечения на участке НО длиной 10—20 мкм в относительных единицах (о.е.), принимая максимальное свечение пикселя, равное 256, за 1. Далее определяли значение фонового свечения как среднюю интенсивность свечения в квадрате 50 х 50 пикселей в участке изображения без НО. Фоновое значение
впоследствии вычитали из каждого пикселя, полученного после усреднения изображения.
Все данные обработаны методами вариационной статистики. Количественные результаты исследования представлены в форме среднее значение ± стандартное отклонение, п — число независимых экспериментов.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Влияние на секрецию медиатора при оди-
ночной и высокочастотной стимуляции. В условиях одиночной (0.2 Гц) стимуляции двигательного нерва аппликация донора Н28—№Н8 в концентрации 100 мкМ не приводила к быстрому и обратимому увеличению амплитуды ТКП, которая к 20-й мин эксперимента составила 140 ± 16% (р < 0.05; п = 5) по отношению к контролю, амплитудно-временные характеристики ТКП не изменялись. Полу-
ченные данные согласуются с ранее проведенными исследованиями и свидетельствуют о том, что NaHS действует на пресинаптическом уровне, вызывая усиление освобождения ацетилхолина из НО [7].
Раздражение двигательного нерва с частотой 20 Гц в течение 3 мин в контроле сопровождалось снижением амплитуды ТКП. К 30-й с стимуляции амплитуд
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.