РАДИАЦИОННАЯ БИОЛОГИЯ. РАДИОЭКОЛОГИЯ, 2014, том 54, № 2, с. 117-126
ОБЩАЯ РАДИОБИОЛОГИЯ
УДК [57+61]::539.1.04:591.11:614.876:599.323.4/.7
ВЛИЯНИЕ СИНТЕТИЧЕСКОГО ПЕПТИДА АКТИВНОГО ЦЕНТРА GM-CSF НА ВОССТАНОВЛЕНИЕ ГЕМОПОЭЗА У МЫШЕЙ С57BL/6 ПОСЛЕ ФРАКЦИОНИРОВАННОГО ОБЛУЧЕНИЯ
© 2014 г. А. В. Аклеев1,2, *, Г. А. Тряпицына1,2, А. С. Симбирцев3, А. А. Аклеев4,
Е. А. Пряхин1,2, А. В. Зурочка5,6
1Уральский научно-практический центр радиационной медицины ФМБА России, Челябинск 2Челябинский государственный университет, Челябинск 3Государственный научно-исследовательский институт особо чистых биопрепаратов ФМБА России,
Санкт-Петербург
4Южно-Уральский государственный медицинский университет, Челябинск 5Институт иммунологии и физиологии УрО РАН, Екатеринбург 6Южно-Уральский государственный университет (национальный исследовательский), Челябинск
В работе оценено влияние синтетического пептида активного центра гранулоцитарно-макрофа-гального колониестимулирующего фактора (GM-CSF) на гемопоэз у мышей как в условиях нормального физиологического состояния животных, так и в период постлучевого восстановления кроветворения. Показано, что синтетический пептид активного центра GM-CSF обладает селективным стимулирующим эффектом у животных с лучевым угнетением гемопоэза. Однократное введение препарата в дозе 0.005 мкг/г самкам мышей C57Bl/6, подвергшихся фракционированному облучению в дозе 10 Гр, у которых развивались угнетение костномозгового кроветворения и цито-пения, оказывало стимулирующий эффект на гранулоцитарный и моноцитарный ростки кроветворения. Введение пептида активного центра GM-CSF облученным животным не влияло на содержание КОЕс в костном мозге (КМ), но оказывало стимулирующее действие на популяцию этих клеток у интактных животных. Не отмечено влияния препарата на развитие экстрамедуллярного кроветворения в селезенке у облученных мышей. Исследование показало, что пептид активного центра GM-CSF является перспективным препаратом для лечения радиационно-индуцированной миелосупрессии.
Нейтропения, гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор, периферическая кровь, костный мозг, у-излучение, мыши.
БО1: 10.7868/80869803114020039
Известно, что стволовые кроветворные клетки (СКК) и клетки-предшественники, обладающие наибольшей радиочувствительностью, являются основной мишенью при радиационном воздействии. Радиационное повреждение их вызывает компенсаторное повышение скорости репарации клеток от сублетальных повреждений, пролифе-ративной активности сохранившихся жизнеспособных клеток, ускорение прохождения клеточного цикла костномозговыми предшественниками и другие эффекты, приводящие к стимуляции гемопоэза. В случае недостаточности вышеуказанных компенсаторных механизмов снижается функциональный резерв и жизнеспособность зрелых клеток крови, что является показателем
* Адресат для корреспонденции: 454076 Челябинск, ул. Воровского, 68А, ФГБУН УНПЦ РМ ФМБА РФ; тел.: (351) 232-79-14; факс: (351) 232-79-13; e-mail: akleyev@urcrm.ru.
неэффективности гемопоэза и клинически проявляется в виде цитопении (наиболее часто гра-нулоцитопении). Цитопения нередко сопровождается изменениями иммунитета. Пострадиационное восстановление гемопоэза характеризуется постепенным восстановлением клеточного состава костного мозга, периферической крови и нормализацией показателей иммунитета, но даже в отдаленные сроки у облученных лиц может сохраняться гранулоцитопения [1, 2]. Данные, полученные в экспериментах на животных, подвергшихся облучению в низких дозах, свидетельствуют о том, что замедленное восстановление клеточного состава костного мозга и периферической крови обусловлено некоторым дефицитом СКК и гемопоэтических предшественников [3].
В рамках настоящей работы в экспериментальной модели предпринята попытка коррекции
гранулоцитопении в период постлучевого восстановления посредством стимуляции кроветворных клеток-предшественников синтетическим пептидом активного центра гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (granulocyte-macrophage colony-stimulating factor — GM-CSF). Применение пептида активного центра GM-CSF позволяет не только понять механизмы отдаленных цитопений у лиц, подвергшихся хроническому радиационному воздействию, но и обосновать применение препарата в клинической практике. Известно, что GM-CSF не только стимулирует пролиферацию и созревание клеток-предшественников и дифференцированных гранулоцитов костного мозга, но и повышает функциональную активность зрелых грану-лоцитов крови [3—5]. До настоящего времени GM-CSF, как и G-CSF, и пегилированный G-CSF остаются единственными препаратами, официально разрешенными Агентством по контролю качества продуктов и лекарств США (US FDA) для коррекции радиационно-индуцированной миелосупрессии и потенциально летального угнетения гранулоцитопоэза после лучевой терапии. Необходимо отметить, что гемопоэтические факторы роста уже применялись в случаях аварийного облучения. Например, при облучении в Гайане (Бразилия) использование GM-CSF оказывало некоторый положительный эффект, но не спасало больных от смерти, вероятно, из-за позднего применения препарата [6]. В последние годы показано, что синтетические пептиды активного центра GM-CSF могут обладать не только коло-ниестимулирующей активностью подобно цельной молекуле фактора, но и иммуностимулирующими, антибактериальными и репарационными свойствами [7, 8]. Принимая во внимание вышесказанное, целью исследования было оценить влияние синтетического пептида активного центра GM-CSF на восстановление лейкопоэза после лучевого повреждения.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДИКА
Влияние пептидного активного центра грану-лоцитарно-макрофагального колониестимулиру-ющего фактора GM-CSF на гемопоэз у мышей оценивалось как на фоне нормального физиологического состояния животных, так и в период постлучевого восстановления гемопоэза. В качестве биологического объекта в исследовании использовали самок мышей линии С57В1. Животных содержали на полноценном рационе, воду не ограничивали. Всего в эксперименте использовано 650 животных. В проведенных ранее экспери-
ментах было показано, что при хроническом воздействии у-излучения с мощностью дозы 4 сГр/сут лейкопения у мышей развивалась при суммарной поглощенной дозе 7 Гр, а выраженная цитопения — при суммарной поглощенной дозе 1O Гр и выше [9]. С учетом этого для индукции ци-топении самок мышей C57Bl/6 подвергали фракционированному облучению (в течение 5 нед с интервалом между фракциями 7 сут, доза на фракцию составляла 2 Гр) в суммарной дозе 1O Гр. Облучение животных проводили на установке "ИГУР-1" (Россия). Мощность дозы у-излучения установки составляла O.7 Гр/мин, неравномерность у-поля в рабочем пространстве составляла не более 5%.
В качестве стимулятора гемопоэза использовали синтетический пептид активного центра гра-нулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (химическая формула — THR NLE NLE ALA SER HIS TYR LYS GLN HIS CYS PRO), произведенный в Государственном научно-исследовательском институте особо чистых биопрепаратов ФМБА России. Синтез пептида проводился твердофазным способом на синтезаторе "Applied Biosystems 43OA" (США) методом in situ c использованием Na-Boc-защищенных производных аминокислот. Для блокирования боковых цепей трифункциональных аминокислотных остатков использованы защитные группы бензильного и уретанового типов. Присоединение аминокислотных остатков проводили методом 1-гидроксибензотриазоловых эфиров, используя 5-кратные избытки реагентов. По завершении сборки полипептидной цепи пептидил-полимер обрабатывали жидким фтористым водородом по Sn1/Sn2 механизмам в присутствии ска-венджеров. Продукт высаживали диэтиловым эфиром и очищали методом препаративной обра-щенно-фазовой хроматографии до гомогенного состояния. Конечные продукты охарактеризованы данными аминокислотного и масс-спектраль-ного анализов. Аминокислотный состав полученных соединений и их молекулярный вес соответствовали теоретическим, чистота по данным аналитической обращенно-фазовой высоко эффективной жидкостной хроматографии была не менее 95%.
Препарат вводили животным в дозе O.OO5 мкг/г. С целью приготовления препарата для введения использовали лекарственную форму лиофилизат, который представляет собой водорастворимый негликозилированный белок. Содержимое флакона (2 мг) растворяли в 2O мл физиологического раствора (раствор № 1). Затем готовили раствор для введения (раствор № 2) в со-
отношении 1 мл физиологического раствора : 1 мкл раствора № 1 препарата. Животным однократно внутрибрюшинно вводили раствор № 2. Животным контрольных групп вводили физиологический раствор в том же объеме.
Для оценки влияния пептида активного центра ОМ-С8Б на состояние гемопоэза у экспериментальных животных было сформировано четыре экспериментальные группы:
1) группа биологического контроля;
2) группа интактных животных, которым вводили пептид активного центра ОМ-С8Б;
3) группа животных, подвергшихся фракционированному облучению в суммарной дозе 10 Гр;
4) группа животных, подвергшихся фракционированному облучению в суммарной дозе 10 Гр, которым вводили пептид активного центра ОМ-С8Е
Через 2 мес после завершающей фракции облучения животным 2-й и 4-й групп однократно внутрибрюшинно вводился пептид активного центра ОМ-СБЕ
Исследование гемопоэза проводилось в течение 9 мес. Первое исследование состояния гемопоэза проводили перед облучением, второе — на следующие сутки после завершающей фракции облучения. Последующие исследования выполнялись через 1, 2 (перед введением пептида активного центра ОМ-СБЕ), 3, 5 и 8 мес после завершения облучения (последние три обследования соответствуют 1, 3 и 6 мес после введения пептида животным 2-й и 4-й групп). Состояние гемопоэза оценивали по количеству КОЕс в костном мозге (экзотест), клеточному составу костного мозга (КМ) и периферической крови, количеству ядросодержащих клеток в селезенке (ЯСК).
Процедуру метода экзотеста проводили в точном соответствии с модификацией, предложенной А.Е. Переверзевым [10].
Забор крови проводили у живых мышей из хвостовой вены
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.