== РАДИАЦИОННАЯ ОНКОЛОГИЯ ^
УДК [57+61]::539.1.04:616-006:614.875:615.831
ВЛИЯНИЕ СИСТЕМНОЙ ФОТОДИНАМИЧЕСКОЙ ТЕРАПИИ НА ОПУХОЛЕВЫЕ КЛЕТКИ, ЦИРКУЛИРУЮЩИЕ В ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ
КРОВИ ОНКОЛОГИЧЕСКИХ БОЛЬНЫХ
© 2013 г. И. А. Замулаева, М. А. Каплан, Н. П. Ткаченко, Е. И. Селиванова, С. А. Макаренко*, О. Н. Матчук, А. М. Шубина, Е. В. Горанская, |А. С. Саенко
Медицинский радиологический научный центр Министерства здравоохранения Российской Федерации, Обнинск
Цель работы — изучение количества циркулирующих опухолевых клеток (ЦОК) в крови онкологических больных в разные сроки после системной фотодинамической терапии (ФДТ) и выявление апоптотической гибели таких клеток. Группу исследования составили 19 больных со злокачественными новообразованиями эпителиального происхождения на разных стадиях (ГГ—ГУ) опухолевого процесса. Идентификацию ЦОК проводили с помощью проточной цитометрии по иммунофеноти-пу Ер-САМ (CD326)+CD45-. Апоптотическую гибель ЦОК выявляли по критерию целостности плазматической мембраны и транслокации фосфатидилсерина на внешнюю поверхность мембраны. Показана отрицательная корреляция между частотой ЦОК и уровнем апоптотической гибели этих клеток у больных до лечения (Я = —0.51, р = 0.03). В течение первых трех суток после ФДТ частота ЦОК постепенно снижалась, затем оставалась на достигнутом уровне до конца наблюдения (7 сут). На индивидуальном уровне эффект ФДТ зависел от частоты ЦОК до лечения: уменьшение частоты этих клеток происходило статистически значимо чаще у больных с исходно высокой, чем низкой частотой ЦОК (р = 0.05). При уменьшении частоты ЦОК апоптотическая гибель увеличивалась уже через 6 ч после воздействия и сохранялась на этом уровне до конца срока наблюдения. Полученные результаты доказывают эффективность применения системной ФДТ для элиминации опухолевых клеток, циркулирующих в периферической крови онкологических больных с разной локализацией первичного очага и стадией заболевания.
Циркулирующие опухолевые клетки, системная фотодинамическая терапия, СБ326, проточная цито-метрия, апоптоз.
БО1: 10.7868/80869803113060167
В последние 10—15 лет во всем мире происходит интенсивное развитие фотодинамической терапии (ФДТ) — нового эффективного метода лечения онкологических заболеваний, основанного на способности ряда веществ (фотосенсибилизаторов — ФС) в сочетании со световым облучением определенной длины волны вызывать деструкцию опухолевой ткани. Эффективность локального фотодинамического воздействия доказана в экспериментальных и клинических условиях в отношении меланомы, рака молочной железы, легкого, мочевого пузыря, пищевода, желудка идр. [1-3].
Накапливается опыт использования системной фотодинамической терапии, которая одновременно с введением фотосенсибилизатора в кубиталь-ную вену пациента включает лазерное облучение крови при помощи световода, вводимого в куби-тальную вену другой руки [4-8]. Однако если механизмы локального фотодинамического воздей-
* Адресат для корреспонденции: 249036, Обнинск, Калужская обл., ул. Королева, 4; ФГБУ МРНЦ Минздрава России; тел.: (48439) 9-71-88; e-mail: makarenko7sa@gmail.com.
ствия на опухолевую ткань изучены достаточно хорошо, то механизмы действия системной ФДТ практически не изучены. Можно предположить, что эффекты системной ФДТ связаны с повреждением циркулирующих клеток, в том числе опухолевых клеток, находящихся в крови онкологических больных и отвечающих за гематогенное мета-стазирование опухоли. При внутривенном введении ФС эти клетки активно поглощают препарат и погибают под действием лазерного излучения. При этом могут выделяться биологически активные вещества, воздействующие на иммунные механизмы по типу специфической противоопухолевой вакцины, причем эти воздействия являются системными, что важно для долгосрочного контроля роста и метастазирования опухоли. Однако в научной литературе до сих пор отсутствуют данные о динамике количества циркулирующих опухолевых клеток (ЦОК) и их гибели после проведения ФДТ. Поэтому целью данной работы является стало изучение количества ЦОК в разные сроки после системной ФДТ и выявление одной из форм клеточной гибели (апоптоза) таких клеток.
ЦОК идентифицировали с помощью проточной цитометрии по иммунофенотипу Ер-САМ (CD326)+CD45- после инкубации клеток периферической крови с соответствующими монокло-нальными антителами, меченными флуорохрома-ми, и дополнительного окрашивания клеточной ДНК флуоресцентным красителем Хёхст33342. В предварительных экспериментах была подтверждена надежность использования такого методического подхода в определенном диапазоне концентраций опухолевых клеток в крови. Апоптоти-ческую гибель ЦОК, идентифицированных по указанному иммунофенотипу, оценивали с помощью стандартной методики по критерию целостности плазматической мембраны и транслокации фосфатидилсерина на внешнюю поверхность мембраны (с помощью флуоресцентного красителя Хёхст 33258 и Аннексина-У, меченного ФИТЦ, соответственно).
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДИКА
В группу исследования вошли 19 пациентов (14 женщин и 5 мужчин) в возрасте от 37 до 72 лет, с опухолями эпителиального происхождения различных локализаций II—1У стадий. Большинство обследованных составили больные раком молочной железы — 9 случаев (5 случаев первично выявленного заболевания и 4 случая прогрессирова-ния), 2 пациента страдали раком легких (1 случай первично выявленного заболевания и 1 случай прогрессирования), у 6 больных была меланома кожи (1 случай стабилизации процесса и 5 случаев прогрессирования заболевания) и у 2 пациентов — плоскоклеточный рак кожи (прогрессиро-вание).
Проводился один сеанс системной фотодинамической терапии, который выполнялся следующим образом: в кубитальную вену пациента ин-фузионно вводился раствор фотосенсибилизатора. Был использован фотосенсибилизатор "Фотолон" (РУП "Белмедпрепараты", Беларусь), который представляет собой комплекс натриевой соли хлорина Е6 и низкомолекулярного медицинского поливинилпирролидона. Рассчитанная доза "Фотолона" — 1.5 мг/кг массы тела — растворялась в 100—200 мл 0.9%-ного раствора натрия хлорида и вводилась внутривенно капельно в течение 50 мин. Одновременно с введением ФС проводилось лазерное облучение крови при помощи световода с насадкой, который вводили в кубитальную вену другой руки. Сеанс ФДТ выполнялся на аппарате "Аткус 0.4". Параметры облучения: длина волны лазерного излучения 661 нм, мощность 20 мВт, время облучения 50 мин.
Системная ФДТ была первым этапом лечения пациентов, в последующем каждый из них получал терапию основного заболевания в соответ-
ствии с "Алгоритмами диагностики и лечения злокачественных новообразований" (полихимиотерапия, лучевое, гормональное, хирургическое лечение, таргетная терапия) [9].
Идентификация и определение относительного количества ЦОК у онкологических больных. Относительное количество ЦОК, в целом, определено в 95 образцах периферической крови 19 больных. Забор крови проводился через 6 ч, 1, 3, 7 сут после сеанса ФДТ.
Метод определения относительного количества (частоты) ЦОК включал окрашивание клеток периферической крови с помощью монокло-нальных антител, ДНК-связывающего красителя и последующий анализ с помощью проточной цитометрии.
Окрашивание образцов крови выполняли следующим образом:
1. В промаркированные пробирки вносили по 20 мкл моноклональных антител к CD326 и CD45 (Becton Dickinson Immunocytometry Systems — BDIS, США), меченных флуоресцеинизотиоцио-натом (ФИТЦ) и фикоэритрином (ФЭ), соответственно. В качестве контроля неспецифического связывания использовали антитела к гемоциани-ну Fissurella: у1-ФИТЦ/у2-ФЭ.
2.В каждую пробирку вносили по 100 мкл гепа-ринизированной крови (20 ед./мл), полученной путем венепункции не позднее чем за 2 ч до анализа, образцы перемешивали и инкубировали в темноте 15—30 мин.
3. Эритроциты лизировали с помощью раствора FACS-Lysing (BDIS, США), который разводили дистиллированной водой в 10 раз, после чего в каждую пробирку вносили 1 мл готового раствора, содержимое перемешивали и инкубировали в темноте 10—12 мин.
4. Осаждали клетки центрифугированием при 300 g 5 мин.
5. Производили двукратное отмывание клеток в 1 мл 0.01 моль/л фосфатного солевого буфера (ФСБ, рН 7.2), содержащего 0.15 моль/л №Cl, с помощью центрифугирования (300g в течение 5 мин).
6. В каждую пробирку вносили по 200 мкл ФСБ и по 5 мкл ДНК-связывающего красителя Хёхст 33342 в концентрации 250 мкг/мл ("Sigma", США). Инкубировали 15 мин и анализировали на проточном цитометре FACS "Vantage" (BDIS, США) в течение 1 ч после окрашивания.
Для измерения флуоресценции ФИТЦ использовали узкополосные фильтры 530/30 нм, ФЭ - 585/30 нм, Хёхста 33342 - 424/20 нм. Мощность первого лазера (488 нм) составляла 56 мВт, мощность второго лазера (364 нм) — 10 мВт.
В каждом образце анализировали по 100— 300 тыс. клеток, данные об интенсивности пря-
CD45-ФЭ 104
103
102
101
100 100
101
CD45-ФЭ
104 -Э
103 -
102 -
101 -
102 103 104 Ep-CAM ^326)-ФИТЦ
100
Ep-CAM+CD45-
_l_I.........I_I.........Li_I.........I.........
100
101
102 103 104 Ep-CAM ^326)-ФИТЦ
Рис. 1. Распределение клеток по интенсивности связывания антител к Ер-САМ (CD326) и CD45. Выделен регион ЦОК в образцах с небольшим (А) и высоким (Б) количеством этих клеток.
мого и бокового светорассеяния, флуоресценции ФИТЦ, ФЭ, Хёхст 33342 сохраняли в файл. Данные обрабатывали с помощью программы "Се1^ие81Рго" (ВЭК, США). Обработку данных начинали с построения графика распределения клеток по интенсивности прямого светорассеяния и Хёхст 33342, на котором выделяли регион ядросодержащих Хёхст 33342+-клеток. Такой подход позволяет дифференцировать ядросодер-жащие клетки от дебриса, конгломератов тромбоцитов и др. неспецифических событий, что, в конечном итоге, повышает точность количественного анализа ЦОК. Для ядросодержащих клеток из выделенного региона строили график распределения по интенсивности связывания антител к СЭ45 и СЭ326 (рис. 1), на котором выделяли регион СВ326+СЭ45- клеток.
Относительное количество (частоту) ЦОК определяли путем деления количества клеток с иммунофенотипом СВ32
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.