БИОХИМИЯ, 2015, том 80, вып. 5, с. 694 - 701
УДК 577.218;57.044
ВЛИЯНИЕ SkQ1 НА ЭКСПРЕССИЮ ГЕНА ФАКТОРА ТРАНСКРИПЦИИ Nrf2, ARE-КОНТРОЛИРУЕМЫХ ГЕНОВ АНТИОКСИДАНТНЫХ ФЕРМЕНТОВ И ИХ АКТИВНОСТЬ В ЛЕЙКОЦИТАХ КРОВИ КРЫС
© 2015 В.В. Внуков, О.И. Гуценко, Н.П. Милютина*, А.А. Ананян, А.О. Даниленко, С.Б. Панина, И.В. Корниенко
Южный федеральный университет, Академия биологии и биотехнологии, 344090 Ростов-на-Дону, просп. Стачки, 194/1; электронная почта: natmilut@rambler.ru
Поступила в редакцию 23.10.14 После доработки 16.01.15
В результате проведенного исследования установлено, что введение SkQ1 в дозе 50 нмоль/кг в течение пяти дней приводит к значительному повышению уровня мРНК гена фактора транскрипции Nrf2 и NrO-ин-дуцируемых генов антиоксидантных ферментов SOD1, SOD2, CAT и Орх4 в лейкоцитах периферической крови крыс. Повышение уровня экспрессии исследованных генов при введении SkQ1 сопровождается возрастанием в лейкоцитах активности каталазы, глутатионпероксидазы и глутатион^-трансферазы. Полученные результаты показывают, что антиоксидантное действие SkQ1 в лейкоцитах может быть связано с влиянием на сигнальную систему Nrf2/ARE.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: митохондриально-адресованный антиоксидант, лейкоциты, экспрессия генов, анти-оксидантные ферменты.
В последние годы интенсивно исследуются механизмы цитопротекторного действия нового класса веществ — митохондриально-направлен-ных антиоксидантов, в конструкции которых используется проникающий катион (ион Скула-чева), связанный с замещенным хиноном [1, 2]. Среди данного класса веществ высокой эффективностью отличаются соединения семейства и его первый представитель 8кр1 — 10-(6'-пластохинонил)децилтрифенилфосфоний, представляющий собой конъюгат проникающего катиона децилтрифенилфосфония и пласто-хинона (компонента электрон-транспортной цепи хлоропластов с мощными антиоксидант-ными свойствами) [2]. Показано, что 8кр1 спе-
Принятые сокращения: ARE — антиоксидант-рес-понсивный элемент (antioxidant responsive element); Cu,Zn-SOD, SOD1 — Cu,Zn-супероксиддисмутаза; CAT — катала-за; EC-SOD, SOD3 — экстрацеллюлярная супероксиддис-мутаза; врх — глутатионпероксидаза; GR — глутатионре-дуктаза; GST — глутатион^-трансфераза; Keap1 — ассоциированный с ЕСН Kelch-подобный белок 1 (Kelch-like association protein 1); Mn-SOD, SOD2 — Mn-супероксид-дисмутаза; Nrf2 — фактор 2, родственный NF-E2 (NF-E2-related factor 2); NF-E2 — семейство белков эритроидного ядерного фактора 2 (nuclear factor erythroid 2); BACT — ген Р-актина (ген сравнения).
* Адресат для корреспонденции.
цифически накапливается во внутренней мембране митохондрий, является возобновляемым антиоксидантом, что позволяет использовать его в наноконцентрациях [2]. Исследованы механизмы антиоксидантного действия 8кр1 и родственных соединений, обусловленные предотвращением окисления митохондриального кардиолипина [2], элиминацией образовавшихся АФК [1, 3], а также частичным разобщением дыхания и фосфорилирования посредством прямого протонофорного действия вещества или вследствие усиления циркуляции анионов жирных кислот, что снижает продукцию АФК митохондриями [4—6].
В настоящее время установлено, что реализация защитных механизмов клетки при окис-лительном/электрофильном стрессе в большой степени связана с активацией редокс-чувстви-тельной сигнальной системы Кеар1/№0, индуцирующей активацию более 200 генов, среди которых гены антиоксидантных белков, ферментов детоксикации и др. [7—9]. Кроме того, показано влияние фактора транскрипции на промежуточный метаболизм и митохондри-альные функции [9]. Найдены соединения-индукторы данной системы, в частности ее ключевого звена — фактора транскрипции №0, среди которых важное место отводится пара- и орто-
гидрохинонам [10]. В связи с этим представляет интерес исследование возможности влияния 8кр1, содержащего в своей конструкции плас-тохинон, на уровень экспрессии гена фактора транскрипции №£2 и №0-индуцируемых генов антиоксидантных ферментов, а также их активность в лейкоцитах крови крыс в условиях физиологической нормы.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Исследование проведено на половозрелых самцах белых крыс Rattus norvegicus массой 180—200 г. Все подопытные животные были разделены на две группы по 10—23 животных. В течение пяти дней крысам вводили SkQ1 по 50 нмоль/кг в день. Рассчитанную дозу препарата, растворенную в 100 мкл 0,2%-ного этанола в дистиллированной воде, вводили в защечные мешки животных. Животные контрольной группы получали в течение пяти дней по 100 мкл 0,2% этанола.
Эксперименты на животных проводились с соблюдением принципов Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых в эксперименте или в научных целях (Страсбург, 18 марта 1986 г.).
Анализ экспрессии мРНК проводили с помощью метода обратной транскрипции с последующей полимеразной цепной реакцией (ОТ-ПЦР) со специфическими праймерами. Для исследования брали 50 мкл крови. Тотальную РНК выделяли методом гуанидин-тиоцианат-фенол-хлороформной экстракции с помощью коммерческого набора «РИБО-золь-B» (ООО «Интер-ЛабСервис», Россия). Качество выделенной РНК оценивали при помощи электрофореза в 1,2%-ном агарозном геле, количество — по оптической плотности при 260 нм. Для синтеза кДНК использовали набор реагентов для обратной транскрипции («Синтол», Россия), содержащий MMLV-RT (ревертазу вируса лейкемии мышей Молони), праймер Random-6, смесь dNTP и ингибитор РНКаз.
Исследование уровня экспрессии генов фактора транскрипции Nrf2 (Nrf2), изоферментов супероксиддисмутазы — Cu,Zn-SOD (SOD1), Mn-SOD (SOD2), экстрацеллюлярной SOD -EC-SOD (SODS), каталазы (CAT), глутатионпе-роксидазы 4 (Gpx4) выполняли методом ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ) в присутствии ин-теркалирующего красителя EVA Green («Molecular Probes», США) с использованием набора реагентов для проведения ПЦР-РВ («Синтол», Россия) и прибора iQ5 Real-Time PCR Detection System («Bio-Rad», США). В качестве гена срав-
нения использовали ген ß-актина (BACT). Специфические праймеры подбирали с помощью программы Primer BLAST и Primer 3. Последовательности специфических праймеров представлены в табл.1.
Для оценки эффективности (E) каждой пары праймеров ПЦР проводили с различными разведениями (1 : 1, 1 : 2, 1 : 4, 1 : 8) кДНК с последующим вычислением усредненного ACt. Эффективность всех используемых пар праймеров представлена в таблице 2.
ПЦР-РВ проводили при следующих условиях: 95° — 5 мин, далее 40 циклов: 58 (60)° — 50 с (детекция флуоресценции), 95° — 15 с. После завершения ПЦР получали графики изменения флуоресценции во времени. Специфичность получаемого продукта амплификации проверяли с помощью кривых плавления продуктов ПЦР.
Анализ графиков накопления продуктов ПЦР проводили с помощью программного обеспечения IQ5 Optical System Software version 2.0 («Bio-Rad», США). Данные ПЦР-РВ обрабатывали с помощью программного обеспечения iCycler IQ5 («Bio-Rad», США). Количественную оценку относительного уровня экспрессии генов рассчитывали по методу ACt с использованием гена сравнения.
Материалом для биохимических исследований служила суспензия лимфоцитов, выделенных из цельной крови в градиенте плотности фиколл-верографина (р = 1,077) по методу Бойум [11]. Клетки трижды промывали и сус-
Таблица 1. Праймеры для ПЦР-РВ
Ген Нуклеотидная последовательность прямого (f ) и обратного (r) праймеров
BACT f: 5'-agccatgtacgtagccatcc-3' r: 5'-tcggaaccgctcattgccg-3'
Nrf2 f: 5'-atgtcaccagctcaagggcacagtgc-3' r: 5'-ccatcctccccgaacctagtt-3'
SOD1 f: 5'-aaccagttgtggtgtcagga-3' r: 5'-ctcctgagagtgagatcaca-3'
SOD2 f: 5'-ttaacgcgcagatcatgcag-3' r: 5'-gtcacgcttgatagcctcca-3'
SODS f: 5'-aggctctttctcaggcctc-3' r: 5'-agatctccaggtctttggag-3'
CAT f: 5'-ttctacactgaagatggtaactg-3' r:5'-gaaagtaacctgatggagagac-3'
Gpx4 f: 5'-ggctacaatgtcaggtt-3' r: 5'-ttatcaatgagaaacttggtaa-3'
Таблица 2. Эффективность используемых пар праймеров
Пара праймеров Эффективность
BACT-f, BACT-r 0,953
Nrf2-f, Nrf2-r 0,970
SOD1-f, SOD1-r 0,930
SOD2-f, SOD2-r 0,873
SOD3-f, SOD3-r 0,933
CAT-f, CAT-r 0, 903
Gpx4-f, Gpx4-r 0,780
пендировали забуференным Tris-HCl-изотони-ческим раствором NaCl, рН 7,4.
Активность супероксиддисмутазы (SOD) оценивали по ингибированию восстановления нит-росинего тетразолия (НТС) супероксидом, генерируемым при аутоокислении адреналина [12]. Активность каталазы определяли по реакции перекиси водорода с молибдатом аммония [13]. Активность глутатионпероксидазы (Орх4) определяли по скорости окисления восстановленного глу-татиона в присутствии гидроперекиси третичного бутила [14], активность глутатион-S-трансферазы (GST) — по оценке скорости реакции ферментативного образования конъюгатов восстановленного глутатиона с 1-хлор-2,4-динитробензолом [15].
Статистическая обработка данных проводилась при помощи пакета программ Biostat (version 2009 Professional - сборка 5.8.4.3 Analyst Soft). Проверка нормальности распределения проводилась по критерию Колмогорова—Смирнова с поправкой Лиллиефорса. Для данных с распределением, отличных от нормального, применялся непараметрический U-критерий Манна—Уитни. Статистическую обработку данных, имеющих нормальное распределение, проводили с использованием t-критерия Стьюдента для малых выборок. Во всех процедурах статистического анализа критический уровень значимости р принимался равным 0,05. При 0,05 < р < 0,1 рассматривали тенденцию к достоверности различий.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
В результате проведенного исследования установлено, что введение 8кр1 в дозе 50 нмоль/кг в течение 5 дней приводит к повышению на 318% уровня экспрессии гена фактора транскрипции в лейкоцитах крови крыс относительно
контроля (рис. 1). Это подтверждается соответствующим повышением относительного уровня мРНК фактора транскрипции Nrf2 по сравнению с нормой. Одновременно было исследовано влияние введения SkQ1 на профиль экспрессии Nrf2-индуцируемых генов антиоксидант-ных ферментов — изоферментов супероксиддисмутазы (SOD 1-3), каталазы (CAT), глутатионпероксидазы 4 (GPx4) — в лейкоцитах крыс. Проведенное исследование показывает, что в лейкоцитах крови крыс на фоне введени
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.