ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2010, том 46, № 3, с. 355-362
УДК 577.156
ВЛИЯНИЕ СОСТАВА СРЕДЫ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ГРИБА Rhizoctonia solani НА СЕКРЕЦИЮ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ
© 2010 г. Н. Н. Кудрявцева, Е. Л. Гвоздева, А. В. Софьин, Т. А. Валуева
Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН, Москва, 119071 e-mail: valueva@inbi.ras.ru Поступила в редакцию 07.08.2009 г.
Изменение состава среды выращивания фитопатогенного гриба Rhizoctonia solani Kühn, особенно доступных источников питания, приводило к изменению не только количества продуцируемых протеиназ, но и их природы и специфичности действия. Минеральный источник азота подавлял секрецию протеиназ у гриба, культивируемого на среде, содержащей термостабильные белки картофеля, а органический источник азота наряду с ускорением роста мицелия повышал их секрецию. На основании анализа субстратной специфичности внеклеточных протеиназ гриба установлено, что присутствие в культуральной среде термостабильных белков картофеля индуцировало секрецию преимущественно трипсиноподобных протеиназ, а добавление к ним белков дрожжевого экстракта — субтилизиноподобных, подавляя при этом продукцию трипсиноподобных ферментов. По-видимому, в среде, обогащенной органическим источником азота, мицелиальный гриб R. solani утрачивает патогенные свойства и становится сапрофитом.
Среди биотических стрессовых факторов, оказывающих влияние на формирование урожая и качественные характеристики сельскохозяйственной продукции, особое место занимают корневые и прикорневые гнили [1], разрушающие мягкие па-ренхимные ткани проростков, что приводит к гибели или снижению адаптивной устойчивости растений к стрессовым факторам [2, 3].
Многие виды грибов Rhizoctonia вызывают заболевания таких экономически важных культур как зерновые, хлопчатник, сахарная свекла, картофель и другие овощные, а также полевых и декоративных растений, плодовых и лесных деревьев [4]. Вследствие заражения грибом Rhizoctonia solani Kühn (семейство Corticiaceae) ежегодная потеря мирового урожая составляет до 20%. Так, при риз-октониозе, распространенном в основных районах выращивания различных сортов картофеля, поражение клубней достигает от 11 до 81%.
Грибы вида Rhizoctonia, относящиеся к группе базидиомицетов (Basidiomycota) и обладающие как фитопатогенной, так и сапрофитной активностью, не образуют асексуальных спор, а растут тонкими вегетативными гифами. По количеству ядер, присутствующих в клетках гиф, эти микроорганизмы разделяют на две группы: бинуклеар-ные и мультинуклеарные [5]. К последней группе относится и R. solani Kühn (AG—3), широко распространенный среди грибов почвенной экосистемы.
Rhizoctonia spp. интересны, в первую очередь, тем, что процесс их видообразования еще не за-
вершен. Предковые штаммы микроорганизма встречаются в целинных почвах и могут скрещиваться с другими штаммами—потомками, которые стали высокоспециализированными паразитами различных сельскохозяйственных культур и уже не способны скрещиваться друг с другом [6]. Эти грибы могут не только действовать как патогены, но и вступать в симбиотические отношения с растениями [7]. При изучении биологических особенностей изолятов Rhizoctonia spp. было показано, что они различаются, как по морфологическим и фитотоксическим свойствам, так и скорости роста при различных температурах [8].
При заражении фитопатогенные грибы продуцируют ряд гидролитических ферментов (в основном протеолитические и карбогидразы). Учитывая специфический осмотрофический тип питания этих грибов можно рассматривать секрецию ими протеиназ как жизненно необходимую, поскольку, с одной стороны, экстрацеллюлярные протеина-зы гидролизуют белки из окружающей среды, делая их доступными для питания, а с другой — участвуют в процессах патогенеза, обеспечивая проникновение патогена в ткани растения-хозяина. Этот набор продуцируемых ферментов определяется экологической нишей обитания грибов, природой деградируемых тканей растения и способом извлечения питательных веществ [9], строго контролируется либо путем индукции их синтеза и секреции, либо катаболитной репрессией этих процессов и зависит от ряда факторов окружающей среды, и в первую очередь от значения
355
7*
рН почвы [10]. Например, у сапрофита Aspergillus nidulans регулируемая pH экспрессия гидролитических ферментов контролируется, по крайней мере, семью генами [11]. Из них ген pacC кодирует транскрипционный фактор, который активируется протеолитическими ферментами при щелочных значениях рН. Этот фактор индуцирует гены, экспрессирующие щелочные протеиназы, и репрессирует гены, экспрессирующие кислые протеиназы. Остальные шесть генов (palA, B, C, F, H, и I) являются компонентами трансдукции, которая также зависит от рН окружающей среды. В работе [12] было высказано предположение, что эта генетическая система строго консервативна у грибов-сапрофитов. Однако ген, гомологичный pacC, был обнаружен у фитопатогена, волокнистого гриба Sclerotinia sclerotiorum [13]. Предполагают, что кислые протеиназы участвуют в обеспечении микроорганизма питанием из окружающей среды и секретируются только при низких значениях рН [14], тогда как изменение рН среды на щелочные значения может служить физиологическим сигналом, запускающим синтез и секрецию некоторых щелочных протеиназ [15, 16].
Известно, что микроорганизмы продуцируют протеолитические ферменты в ответ на истощение в среде легко доступных питательных веществ, вследствие чего, по-видимому, может снижаться катаболитная репрессия и активироваться синтез и секреция экзоферментов, например, по механизму субстрат-специфичной индукции [17, 18].
Ранее было показано, что при культивировании в среде, содержащей термостабильные белки картофеля, фитопатогенный гриб R. solani секре-тировал внеклеточные протеиназы с оптимумом действия в области слабощелочных значений рН [19]. Эти ферменты, охарактеризованные по субстратной специфичности и результатам ингиби-торного анализа, содержали в основном, трипси-ноподобные сериновые протеиназы.
Цель работы — изучение влияния компонентов среды на секрецию фитопатогенным грибом R.. solani внеклеточных протеиназ и их состав.
МЕТОДИКА
В работе использовали культуру фитопатоген-ного гриба R. solani Kühn (AG-3) изолят 153, полученную из Научно-практического центра по картофелеводству и плодоовощеводству НАН Беларуси. Гриб выращивали на овсяно-агаровой среде. В культуральную среду вносили растворимые термостабильные белки, которые получали при кипячении измельченных клубней картофеля в воде (100 г/л) в течение 1 ч и последующего фильтрования через ватный фильтр. К 1 л фильтрата добавляли (г): КН2Р04 -1.5, MgSO4 • 7Н20 - 0.25, FeSO4 • 7Н20 — 0.01, тиамин — 0.01 и рибофлавин —
0.01 (среда I). Для приготовления среды II к тем же компонентам добавляли дрожжевой экстракт (0.05%), являющийся богатым источником питательных веществ, в частности, азота.
Инфицирование культуральной среды проводили в колбах Эрленмейера (500 мл), внося 10 мл суспензии мицелия в дистиллированной воде в 250 мл культуральной жидкости (КЖ). Для выделения экзопротеиназ использовали КЖ на 12 (среда I) и 9 (среда II) сут выращивания культуры.
Частичную очистку экзопротеиназ проводили осаждением белков КЖ либо ^Н4)^04 с конечной концентрацией 80%, либо ацетоном, охлажденным до —20°С (объемное соотношение КЖ-ацетон равно 1 : 2). Осадок отделяли центрифугированием при 10000 % в течение 30 мин, растворяли в деионизованной воде и лиофильно высушивали.
Для высокоэффективной гель-хроматографии (ВЭГХ) использовали колонку (300 х 7.8 мм) Вю-Sep-SEC-S2000 ("РИепошепех", США) и жидкостной хроматограф Стайер ("Аквилон", Россия). Сорбент уравновешивали 0.05 М К-фосфатным буфером, рН 7.0, содержащим 0.5 М КС1. Элюцию проводили тем же буфером (скорость 1 мл/мин).
Протеолитическую активность ферментов определяли при 37°С, используя в качестве субстрата 0.5%-ный азоказеин в 0.1 М трис-НС1-буфере, рН 7.5 [20]. За единицу протеолитической активности (Е) принимали количество фермента, которое вызывало увеличение на 0.1 за 1 мин оптической плотности D366 супернатанта после осаждения инкубационной смеси ТХУ.
Амидазную активность ферментов определяли по методу [21], используя я-нитроанилиды: ^а-бензо-ил-DL-aргининa (БАПА), ^карбобензокси^-ала-нил^-аланил^-лейцина (КбзААЛПА), ^сукци-нил-глицил-глицил^-фенилаланина (СукГГФПА). Концентрация субстрата в реакционной смеси составляла 0.5 мМ. За единицу амидазной активности (АЕ) принимали количество фермента, которое гид-ролизует 1 нмоль субстрата за 1 мин.
Электрофорез в 20%-ном ПААГ в присутствии ДДС-№ и р-меркаптоэтанола (ДДС-ПААГ) проводили по методу Лэммли [22]. Гели окрашивали 0,1%-ным раствором Кумасси R-250 в 20%-ном этаноле, содержащем 5% формальдегида.
Для получения зимограмм ДДС-ПААГ-элек-трофорез проводили в присутствии сополимери-зованного субстрата (0.1% желатины) по методу [23]. Препараты наносили без предварительного прогревания. По окончании электрофореза гели промывали 2.5%-ным раствором тритона Х-100 при интенсивном перемешивании, ополаскивали 0.1 М глицин-№ОН-буфером, рН 7.8, и инкубировали в том же буфере в течение ночи при комнатной температуре. Гели окрашивали 0.1%-ным раствором амидочерного в смеси этанол—уксусная кислота—вода (3 : 1 : 6) в течение 1 ч и отмы-
вали тем же раствором без красителя. Белки, обладающие протеолитической активностью, обнаруживали как бесцветные полосы на синем фоне окрашенной желатины.
Содержание белка определяли по модифицированному методу Брэдфорд, используя в качестве стандарта БСА [24].
В работе использовали азоказеин производства Вильнюсского завода ферментных препаратов (Литва), СукГГФПА и КбзААЛПА ("Serva", Германия), БАПА "Fluka" (Швейцария), набор белков-маркеров для ПААГ-электрофореза (LMW Calibration Kit) "Pharmacia", Швеция), набор белков-маркеров для гель-хроматографии (LMW Colibration Kit) - фирмы "Phenomenex" (США).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
В нашей предыдущей работе [19] было показано, что при росте на среде, содержащей термостабильные белки картофеля (среда I), фитопатоген-ный гриб R. solani продуц
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.