научная статья по теме ВЛИЯНИЕ СОСТОЯНИЯ ПОКОЯ НА ШТАММ PSEUDOMONAS FLUORESCENS 26К – ДЕСТРУКТОР КСЕНОБИОТИКОВ Биология

Текст научной статьи на тему «ВЛИЯНИЕ СОСТОЯНИЯ ПОКОЯ НА ШТАММ PSEUDOMONAS FLUORESCENS 26К – ДЕСТРУКТОР КСЕНОБИОТИКОВ»

МИКРОБИОЛОГИЯ, 2013, том 82, № 5, с. 552-562

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ

УДК 579.242:579.222.2

ВЛИЯНИЕ СОСТОЯНИЯ ПОКОЯ НА ШТАММ PSEUDOMONAS FLUORESCENS 26К - ДЕСТРУКТОР КСЕНОБИОТИКОВ

© 2013 г. И. П. Соляникова*, Н. Е. Сузина*, **, А. Л. Мулюкин***, Г. И. Эль-Регистан***, Л. А. Головлева*, **, 1

*Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, Пущино **Пущинский государственный естественно-научный институт ***Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН, Москва Поступила в редакцию 09.11.2012 г.

Выявлены и охарактеризованы изменения физиолого-морфологических и биохимических свойств штамма Pseudomonas fluorescens 26K — деструктора хлорсодержащих ароматических соединений, после его пребывания в состоянии покоя в виде цистоподобных покоящихся клеток (ЦПК). ЦПК псевдомонад характеризовались длительным сохранением колониеобразующей способности, повышенной устойчивостью к повреждающим воздействиям (термообработке, высушиванию) и особенностями ультраструктурной организации. При рассеве ЦПК на плотных средах в вырастающих популяциях обнаружены колониально-морфологические варианты, отличные от доминантных типов по форме, консистенции и пигментации колоний. Выщепившиеся фенотипы характеризовались более высокой скоростью роста клеток на некоторых ароматических субстратах, для утилизации которых необходимы ферменты с расширенной субстратной специфичностью.

Ключевые слова: псевдомонады, покоящиеся формы, устойчивость, биодеградация ксенобиотиков, ферментативная активность.

DOI: 10.7868/S0026365613050145

Многие виды бактерий рода Pseudomonas способны разлагать широкий спектр ксенобиотиков, таких как хлорбензоаты, хлорфенолы, хлорбифе-нилы и их незамещенные аналоги. Известно, что способность бактерий данного рода осуществлять реакции деградации опосредуется набором ферментов с различной субстратной специфичностью. Псевдомонады характеризуются высокими метаболической активностью и скоростью роста, множественными изоферментами, что делает их перспективными для целей биоремедиации загрязненных экотопов [1—5]. Вместе с тем, в природных условиях период метаболической активности определенной популяции псевдомонад достаточно короток, после чего они переходят в состояние покоя, уступая место популяции другого штамма-деструктора. Поэтому для биореме-диации целесообразно использовать не отдельные штаммы бактерий-деструкторов, а активные ассоциации. Хорошие результаты получены при создании ассоциаций бактерий, принадлежащих к разным таксономическим группам и дополняющим друг друга по своим физиолого-биохимиче-ским характеристикам. Примером эффективно-

1 Автор для корреспонденции (e-mail: golovleva@ibpm. pushchino.ru).

сти такого подхода является применение бактерий двух родов — Pseudomonas и Rhodococcus — для создания бинарных бакпрепаратов для биореме-диации почв, загрязненных нефтью, или для обеззараживания газовых выбросов [4—7].

Ранее нами было показано, что бактерии рода Rhodococcus, как и другие неспорообразующие бактерии, в неростовых или неблагоприятных условиях (например, голодания) способны образовывать цистоподобные покоящиеся клетки (ЦПК), предназначенные для длительного выживания. При прорастании ЦПК Rhodococcus opacus 1cp развивались фенотипические варианты, обладавшие существенно повышенным биодегра-дативным потенциалом [8]. Причиной этого, по-видимому, явилась возможность у выщепивших-ся фенотипов быстро реализовывать нужный биодеградативный путь, что значительно сократило время адаптации культуры к новым для нее субстратам. Что касается псевдомонад, известно, что в лабораторных условиях и почвенных микрокосмах они плохо переносят голодание и утрачивают способность к образованию колоний [9, 10]. Поэтому интерес представляло как выявление клеточных форм выживания псевдомонад в неростовых условиях, так и определение характери-

стик фенотипов, выросших после посевов покоящихся форм в (на) свежие среды.

Цель работы состояла в получении покоящихся форм Pseudomonas fluorescens 26K, изучении их морфологии и ультраструктурной организации, а также исследовании деградативного потенциала культур псевдомонад, развивающихся из покоящихся клеток.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Микроорганизм и условия культивирования.

Объектом исследований была грамотрицательная неспорообразующая бактерия Pseudomonas fluore-scens 26 K, выделенная из сточных вод коксохимического производства Карагандинского металлургического комбината и способная расти на нафталине, м- и я-крезоле, фенантрене, салициловой и фталевой кислотах, 3,4-дихлор- и 3,4-ди-фторанилине [11—12] и трансформировать флуо-рен [13].

Штамм поддерживали пересевами на косяках с LB-агаром. Для получения инокулята культуры P. fluorescens растили на богатой среде — LB-бу-льоне при 28°С в колбах объемом 250 мл с 50 мл среды на качалке (220 об/мин) до фазы линейного роста.

Определение устойчивости клеток к антибиотикам. Устойчивость штамма к антибиотикам оценивали по задержке или отсутствию роста клеток в жидкой среде LB (в 48-луночных плашках), в которую вместе с инокулятом (до конечной плотности 107 кл/мл) вносили канамицин, тетрациклин или ампициллин в диапазоне концентраций 0.01—200 мкг/мл. Плашки инкубировали при 28°С в статических условиях в течение 1—3 сут и периодически просматривали для выявления концентраций антибиотика, обусловливающих биоцидный эффект.

Получение покоящихся форм. Цистоподобные покоящиеся клетки (ЦПК) получали в стареющих культурах, развивающихся: (1) в бедной питательной среде с двух- и пятикратно сниженным содержанием источника N; (2) при внесении в культуры псевдомонад стационарной фазы, выросшие на LB-бульоне, химического аналога микробных аутоиндукторов анабиоза — С12-АОБ (М = 194) в концентрации 1 х 10-4-7 х 10-4 М; (3) при росте культур на почвенном агаре в чашках Петри с последующим смывом клеток и перенесением в 5 мл физраствора с каждой чашки. Подробное описание методов получения ЦПК приведено в работе [14].

Общее число клеток в суспензиях оценивали по результатам прямых микроскопических подсчетов в 20 малых квадратах (25 мкм2) в камере Горяева. Колониеобразующую способность клеток (КОЕ/мл) определяли при посевах клеточ-

ных суспензий, разведенных в 10N раз, на чашки с LB-агаром (1.5% в/об агара), которые инкубировали при 28°С в течение 3 сут. Наиболее вероятное число клеток (НВЧК/мл), способных к росту в LB-бульоне, оценивали методом предельных разведений (МПР) при инокулировании лунок в плашках (50 мкл суспензии в 450 мкл LB-бульона).

Термоустойчивость определяли при подсчете числа клеток, оставшихся жизнеспособными после прогревания клеточных суспензий (0.7 мл) в термостате при температурах 50, 55, 60°С в течение 5 мин.

Микроскопические наблюдения проводили с использованием светооптического микроскопа Reiсhert ("Zetopan", Австрия) и Axioplan ("Carl Zeiss", Германия), снабженного фазово-кон-трастным устройством. Для электронно-микроскопических исследований осажденные клетки фиксировали в 1.5% растворе глютарового альдегида в 0.05 М какодилатном буфере (рН 7.2) при 4°С в течение 1 ч; трижды отмывали в том же буфере и дополнительно фиксировали в 1% растворе OsO4 в 0.05 М какодилатном буфере (рН 7.2) в течение 3 ч при 20°C. После обезвоживания материал заключали в эпоксидную смолу Epon 812. Ультратонкие срезы контрастировали в течение 30 мин в 3% растворе уранилацетата в 70% спирте и дополнительно окрашивали цитратом свинца по Рейнольдсу [15] при 20°С в течение 4—5 мин. Срезы просматривали в электронном микроскопе JEM-100B (JEOL, Япония) при ускоряющем напряжении 80 кВ.

Диссоциативный спектр штамма P. fluorescens 26K определяли при рассеве ЦПК на плотных средах. В вырастающих популяциях выявляли колониально-морфологические варианты (диссо-цианты), отличные от доминантного фенотипа по форме, консистенции и пигментации колоний. Исходным фенотипом для получения ЦПК и исследования фенотипической вариабельности был доминантный S-вариант. Для выявления ан-тибиотикоустойчивых вариантов использовали плотные среды с канамицином (10 мкг/мл). Индекс диссоциации определяли как процентную долю колоний определенных типов к общему числу колоний. Для изучения стабильности дис-социантов использовали метод многократных пассажей.

Оценка способности утилизировать ароматические субстраты. Суспензии ЦПК (10-15 мкл) высевали на агаризованную богатую среду LB. Адаптацию культур P. fluorescens 26К, выросших при рассеве ЦПК или вегетативных клеток, к токсичным субстратам проводили путем многократных пересевов на минеральной агаризованной среде, содержащей: фенол; 2-хлорфенол (2-ХФ); 2,3-; 2,4-; 2,5-; 2,6-; 3,4-дихлорфенолы (ДХФ); 2,3,4-; 2,4,5-; 2,4,6-трихлорфенолы (ТХФ); пента-

хлорфенол (ПХФ); 2-, 3-, 4-хлорбензоаты (ХБК); 2,4-; 2,5-; 2,6-; 3,5-дихлорбензоаты (ДХБК); и-оксибензоат (ПОБК); гентизат; бензоат; салици-лат; 5-хлорсалицилат; и-толуат. Жизнеспособность клеток после 4 последовательных пересевов оценивали по наличию роста при инокуляции клеток в пробирки с 10-кратно разбавленным LB-бульо-ном (7—10 мл) и культивировании на качалке (29°С, 220 об/мин) в течение 5 сут.

Для изучения ростовых характеристик штамма P. fluorescens 26K на ароматических субстратах использовали жидкую минеральную среду следующего состава (г/л): Na2HPO4 - 0,73; KH2PO4 - 0.35; MgSO4 • 7H2O - 0.1; NaHCO3 - 0.25; MnSO4 - 0.002; NH4NO3 - 0.75; FeSO4 • 7H2O - 0.02, содержащую в качестве единственного источника углерода и энергии определенные ростовые субстраты. К среде добавляли раствор микроэлементов (1 мл/л) следующего состава (мг/л): ZnSO4 -0.30; CoCl2 • 6H2O - 0.70; (NH4)6Mo7O24 - 0.86; CuSO4 • 5H2O - 0.25. Выросшую на скошенном агаре биомассу смывали минеральной средой и культивировали в колбах Эрленмейера объемом 750 мл, содержащих 100 мл среды (29°С, 220 об/мин). В качестве единственных источников углерода и энергии вносили и-толуат (70 мг/л); 2,6-ДХБК (50 мг/л); 3-ХБК (200 мг/л); ПОБК (70 мг/л); гентизат (400 мг/л); бензоат натрия (200 мг/л).

Ростовые характеристики культур - максимальную удельную скорость роста (ц) и время удвоения клеток (td),

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком