ИЗВЕСТИЯ РАН. СЕРИЯ БИОЛОГИЧЕСКАЯ, 2014, № 3, с. 254-263
ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ =
УДК 581.19:517.152.1
ВЛИЯНИЕ СТРЕССОВЫХ УСЛОВИЙ НА АКТИВНОСТЬ И ИЗОФЕРМЕНТНЫЙ СОСТАВ ПЕРОКСИДАЗЫ ВАКУОЛЕЙ И ТКАНЕВОГО ЭКСТРАКТА КОРНЕПЛОДОВ СТОЛОВОЙ СВЕКЛЫ
© 2014 г. Е. В. Прадедова, О. Д. Нимаева, Р. К. Саляев
Сибирский институт физиологии и биохимии растений СО РАН, 664033 Иркутск, а/я 317
E-mail: praded@sifibr. irk.ru Поступила в редакцию 20.09.2011 г.
Обнаружено изменение ферментативной активности фенолзависимой пероксидазы (ПО) вакуолей и тканевого экстракта корнеплодов столовой свеклы (Beta vulgaris L.) в разных фазах развития растения, а также при гиперосмотическом стрессе и инфицировании патогенами. Самая высокая активность ПО была в период роста корнеплода, а самая низкая — в период покоя. Активация фермента отмечена у инфицированных корнеплодов. Показано, что изоферментный состав ПО отличался лабильностью, значительно варьировало число катионных изоформ. В зависимости от фазы развития и стрессового воздействия изменялся оптимум pH для фермента, наблюдалась тенденция его смещения к низким значениям в период покоя и при гиперосмотическом стрессе, сдвиг оптимума pH совпадал с появлением дополнительных катионных изоформ ПО.
DOI: 10.7868/S0002332914030114
Немаловажное значение в эффективном функционировании антиоксидантной системы (АС) имеет компартментализация антиоксидантов (АО) в отдельные субклеточные структуры (Колупаев, 2007). К настоящему времени достигнут значительный прогресс в понимании функционирования локальных компонентов АС, сосредоточенных в таких клеточных структурах, как пластиды, митохондрии, пероксисомы и клеточные стенки (Полесская, 2007). Однако по-прежнему недостаточно исследованной остается АС центральной вакуоли.
Широко известный фермент-антиоксидант, защищающий растительные клетки от окислительного повреждения, — фенолзависимая (гвая-коловая) пероксидаза (ПО, КФ 1.11.1.7). Несмотря на то что ПО обнаружена в вакуолях многих растений, ее функции исследованы неполно и несистематично (Bernai et al., 1994; Costa et al., 2008).
Ранее мы установили, что в вакуолях корнеплодов столовой свеклы (Beta vulgaris L.) присутствует ПО, которая эффективно функционирует при низких значениях pH и имеет высокое сродство к бензидинам (Ишеева и др., 2009). Этот фермент представлен широким спектром анионных и основных изоформ, функция которых не ясна. Существует мнение, что одно из назначений ПО вакуолей — окисление алкалоидов, бета-цианинов и других соединений фенольной природы (Bernai et al., 1994; Martinez-Parra, Munoz, 2001; Полесская, 2007; Costa et al., 2008). Исследования, проведенные в последнее время, показали, что ПО — бифункциональный фермент, "специализация" которого зависит от стадии развития
окислительного стресса. При одних условиях он утилизирует H2O2, а при других, например при более высоких значениях pH, напротив, генерирует супероксидные анион-радикалы, которые в результате образуют H2O2. Благодаря этому свойству ПО клеточных стенок является главной ре-докс-системой апопласта и резкое увеличение Н2О2 в апопласте при патогенезе и других видах стресса в большей степени связано с ее активацией (Минибаева, Гордон, 2003). В связи с этим можно предположить, что функций у вакуоляр-ной ПО, как и у ПО клеточных стенок, может быть значительно больше.
Когда пытаются выяснить роль или функцию фермента АС, как правило, моделируют условия, которые стимулируют окислительный стресс у исследуемого растения, и по уровню ферментативной активности судят о вкладе фермента в защитную реакцию клеток. Подобные эксперименты значительно упрощаются с таким объектом исследования, как корнеплод столовой свеклы (B. vulgaris L.), который в онтогенезе растения проходит ряд ключевых этапов развития. Он формируется и растет летом в период высоких температур и влажности (первый год вегетации). Зимой он переживает стадию покоя, которая протекает при пониженных температурах и влажности, т.е. корнеплод длительное время находится под воздействием стрессовых факторов. Следует отметить, что на фоне низкотемпературного стресса и водного дефицита в период покоя корнеплод подвержен особенно сильному действию патогенных микроорганизмов. Все перечисленные виды стресса со-
провождаются окислительным взрывом и активацией АС (Колупаев, 2007; Полесская, 2007). При длительном воздействии неблагоприятных факторов, а период покоя длится несколько месяцев, может развиться окислительный стресс, сопровождающийся ослаблением антиоксидантной защиты.
Цель работы — исследовать активность ПО и ее изоферментный состав на разных стадиях развития корнеплода столовой свеклы и одновременно изучить активность и изоферментный состава ПО при гиперосмотическом стрессе и инфицировании корнеплодов микроорганизмами.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Растения свеклы (B. vulgaris L.) сорта Бордо-237 выращивали на опытном участке СИФИБР. Зимой корнеплоды свеклы хранили при 4°C. Для экспериментов отбирали корнеплоды во время активного роста в первый год вегетации (август) и в период покоя (сентябрь—июнь). Период покоя условно разделили на три фазы: начало покоя — это первые недели после уборки и укладки корнеплодов на хранение (сентябрь); глубокий покой (декабрь—март); выход из покоя, когда у корнеплодов начинали формироваться новые вегетативные побеги и боковые корни (май—июнь).
Исследовали влияние таких стрессовых факторов, как гиперосмотический стресс и патогенез. Гиперосмотический стресс развивается у растений в связи с обезвоживанием их тканей при водном дефиците. Чтобы вызвать обезвоживание тканей, корнеплоды опытного варианта выдерживали при комнатной температуре на открытом воздухе в течение 5 сут до появления заметных признаков увядания. Корнеплоды контрольного варианта хранили при 4°C. Для проведения серии таких опытов брали корнеплоды в первые недели после уборки. В начале эксперимента и через 5 сут корнеплоды опытного и контрольного вариантов взвешивали. Затем из их тканей получали сок. Для этого ткани растирали, отжимали сок, который центрифугировали 10 мин при 12000 g. После этого определяли pH сока на рН-метре 766 (Knick, Германия) и измеряли осмотичность на осмометре ОМКА 1Ц-01 (Россия).
Когда исследовали активность ферментов и их изоферментный состав в связи с действием патогенных микроорганизмов, в фазе выхода из покоя отбирали инфицированные естественным путем корнеплоды с выраженными внешними признаками заболевания. По характерным симптомам были определены широко распространенные заболевания свеклы: ризоктониоз (возбудитель Rhizoctonia solani Kuehn (syn. R.. aderholdii Kolosch.)), серая гниль (возбудитель Botrytis cinerea Pers. ex Fr.) и фомоз (возбудитель Phoma betae Frank.) (Наумов, 1940). Из корнеплодов вырезали
участки неповрежденных тканей, из которых получали изолированные вакуоли или водные экстракты.
Вакуоли из тканей корнеплода выделяли модифицированным макрообъемным методом (Са-ляев и др., 1981). Фракцию изолированных вакуолей дополнительно очищали от примесей орга-нелл (пластид, ядер) и клеточных стенок в ступенчатом градиенте плотности сахарозы—KCl (1.050-1.080-1.145-1.180 г/см3). Растворы разной удельной плотности для градиента готовили путем смешивания двух матричных растворов: 1 М KCl и 1.8 М сахарозы (20 мМ Tris-HCl, pH 7.4) (Кузеванов и др., 1985). Полученный градиент с вакуолярной фракцией центрифугировали в течение 20 мин при 125 g. Очищенную таким образом фракцию вакуолей наблюдали с помощью светового микроскопа (Carl Zeiss, Германия). Чистоту фракции и интактность вакуолей также исследовали биохимическими методами, а именно определяли ДНК (маркер ядер, пластид и митохондрий) и активность маркерных ферментов (НАДФ- и НАД-малатдегидрогеназы, цитохром-с-оксидазы, ка-талазы) (Побежимова и др., 2004; Прадедова и др., 2009). Вакуолярное содержимое извлекали путем разрушения изолированных вакуолей в гипотонической среде (50 мМ K-Na-фосфатном буфере, pH 7.2) с последующим центрифугированием в течение 5 мин при 14000 g.
Для получения экстрактов ткань корнеплода гомогенизировали в соотношении 1 : 3 (ткань-среда) в 100 мМ K-Na-фосфатном буфере, pH 7.8. Фильтрат центрифугировали 10 мин при 10500 g.
Мембранную фракцию (тонопласт) получали из изолированных вакуолей, которые разрушали в гипотоническом растворе (1 мМ MgCl2, 1 мМ ß-меркаптоэтанол, 1 мМ Tris-HCl, pH 7.4). После предварительной очистки лизата от примесей с помощью центрифугирования в течение 15 мин при 8000 g везикулы тонопласта осаждали при 60000 g в течение 60 мин (Саляев и др., 1981; Кузеванов и др., 1985). Белок из везикул тонопласта экстрагировали методом "замораживания—оттаивания" с использованием жидкого азота. Фракцию мембраносвязанных белков извлекали с помощью 0.05%-ного Triton Х-100, который добавляли в 50 мМ K-Na-фосфатный буфер, pH 7.2. Экстракты центрифугировали 15 мин при 10 500 g.
В полученных образцах определяли активность ПО. Исследования проводили на планшетном спектрофотометре 680 (Bio-Rad, США) при длине волны 450-490 нм в реакционной смеси: 6 мМ Н2О2, 70 мМ 3.3'-диаминобензидин-4HCl (ДАБ) или 80 мМ гваякола (ГВ), 100 мМ цитрат-но-фосфатного буфера, pH 3—11. Ферментативную активность рассчитывали с учетом коэффициента экстинкции (E) для каждого субстрата (для ГВ E = 26.6 мМ-1 см-1, для ДАБ E = 30 мМ-1 см-1) и вы-
ражали в условных единицах на 1 мг белка (Ranieri et al., 2001). Содержание белка в пробах определяли методом Брэдфорд (Bradford, 1976).
Изоферментный состав ПО исследовали методом изоэлектрофокусирования (ИЭФ) белков в полиакриламидном геле (ПААГ) (Остерман, 1983). Применяемый ПААГ (T - 5%; C - 3%) содержал 10% глицерина и 3% амфолитов, pH 3-10 (Fluka, Швейцария). В качестве анолита использовали 0.06 N H3PO4, а в качестве католита — 0.1 N NaOH. Маркером перемещения служили калибровочные белки для ИЭФ, изоэлектрические точки которых находились при pH 4—9 (Pharmacia, Швеция). Экстракты, полученные из ткани корнеплода и вакуолярных фракций, подвергали частичной очистке с помощью двухчасового диализа в дистиллированной воде при 4°С. Анализируемые пробы со
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.