ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК, 2015, том 461, № 1, с. 110-113
КЛЕТОЧНАЯ БИОЛОГИЯ
УДК 579.61:579.264:612.017.11
ВЛИЯНИЕ СУПЕРНАТАНТОВ СМЕШАННОЙ КУЛЬТУРЫ Pseudomonas aeruginosa И Escherichia coli НА АПОПТОЗ, НЕКРОЗ И ОКИСЛИТЕЛЬНУЮ АКТИВНОСТЬ НЕЙТРОФИЛОВ
© 2015 г. М. В. Кузнецова, И. Л. Масленникова, И. В. Некрасова, С. В. Ширшев
Представлено академиком РАН В.А. Черешневым 18.08.2014 г. Поступило 25.08.2014 г.
DOI: 10.7868/S0869565215070269
Pseudomonas aeruginosa является одним из основных возбудителей инфекций, связанных с оказанием медицинской помощи, которые нередко заканчиваются летальным исходом у пациентов с ослабленным иммунитетом. Это обусловлено продукцией многочисленных факторов вирулентности: экзотоксинов, пигментов, гемолизинов. Результаты последних лет позволили констатировать, что при ряде инфекционных процессов эти бактерии часто встречаются в составе ассоциаций с представителями других видов грамотрицатель-ной микробиоты, в том числе с Escherichia coli [1].
Нейтрофилы человека являются главными участниками воспалительного процесса, обеспечивая защиту организма при бактериальном инфицировании. Известно, что на жизнеспособность и функции нейтрофилов существенное влияние оказывают микробные внеклеточные факторы P. aeruginosa и E. coli [2].
Ранее нами показано, что P. aeruginosa и E. coli в составе ассоциации меняют не только свой физиологический статус, но и уровень продукции эк-зометаболитов [3]. Баланс между апоптозом и некрозом нейтрофилов, равно как и реализация ими кислородзависимых механизмов бактерицидности в большинстве случаев определяет исход воспаления и степень повреждения тканей при элиминации патогенов. Предполагается, что экзометабо-литы смешанных бактериальных культур будут отличаться по воздействию на нейтрофилы от моновидовых культур и не всегда соответствовать теоретическим предпосылкам, исходя из физиологических характеристик указанных видов, взятых по отдельности.
Институт экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения Российской Академии наук, Пермь
E-mail: maslennikova@rambler.ru
Цель работы — изучить влияние супернатантов смешанной и моновидовых культур P. aeruginosa и E. coli на степень апоптоза, первичного некроза и окислительную способность нейтрофилов человека in vitro.
Изучено влияние супернатантов смешанной и моновидовых культур P. aeruginosa и E. coli на уровень апоптоза, первичного некроза и окислительный потенциал нейтрофилов человека. Установлено, что супернатанты P. aeruginosa усиливают процессы некроза нейтрофилов (AnV-/PI+), не влияя на уровень апоптоза клеток (AnV+/PI-). Супернатанты E. coli снижают жизнеспособность нейтрофилов, при этом количество некротизированных клеток не изменяется, а апоптотических — увеличивается, но только по сравнению с P. aeruginosa. Экспозиция нейтрофилов с экзометаболитами смешанной культуры проявляется в достоверном увеличении жизнеспособных клеток и снижении процессов некроза нейтрофилов по сравнению с действием супернатантов P. aeruginosa. Все супер-натанты усиливают выработку активных форм кислорода (АФК) нейтрофилами. Наиболее выраженным эффектом на продукцию АФК обладают супернатанты смешанной культуры. Таким образом, in vitro экзометаболиты, полученные при совместном росте P. aeruginosa и E. coli, в отличие от монокультуральных продуктов данных бактерий менее токсичны для нейтрофилов человека.
Референтный штамм P. aeruginosa ATCC 27853 (F-51) (National Collection of Dairy Cultures, США) и штамм E. coli K12 TG1 pF1 lux+ Apr [4] выращивали на среде LB (lysogeny broth — литиче-ская среда, "Sigma", США) при 37°C, 18-20 ч в моновидовой и смешанной культуре. Внеклеточные супернатанты получали путем фильтрации (диаметр пор — 0.2 мкм, "Хийу Калур", Эстония).
Продукцию пигментов определяли в 100 мкл супернатантов спектрофотометрическим методом согласно Deziel и соавт. [5]. Количество пио-цианина измеряли по оптической плотности при
ВЛИЯНИЕ СУПЕРНАТАНТОВ СМЕШАННОЙ КУЛЬТУРЫ
111
Таблица 1. Содержание внеклеточных экзопродуктов в составе супернатантов смешанной и моновидовых культур P. aeruginosa и E. coli
Варианты супернатантов
Показатель ---
P. aeruginosa E. coli P. aeruginosa + E. coli
Пиоцианин 0.28 ± 0.01 - 0.15 ± 0.02*
Пиовердин 460 ± 13 - 448 ± 13*
Экзополисахариды (мг/мл) 1.57 ± 0.05 0.61 ± 0.11# 0.71 ± 0.02*
Примечание. * — p < 0.05 между супернатантами моновидовой и смешанной культуры P. aeruginosa + E. coli; # — p < 0.05 между супернатантами моновидовых культур.
695 нм, пиовердина — по флуоресценции при длине волны возбуждающего излучения 400 нм, детектируемого излучения — 460 нм на мульти-планшетном ридере Synergy H1 ("BioTec", США). Количество экзополисахарида определяли кис-лотно-фенольным методом [6].
Нейтрофилы выделяли из гепаринизирован-ной венозной крови здоровых мужчин (19—36 лет, n = 8) центрифугированием в двойном градиенте плотности фиколл-верографина (1.077 и 1.112 г/мл). Клетки (106 клеток/мл) инкубировали 30 мин при 37°C с супернатантами смешанной и моновидовых культур E. coli и P. aeruginosa. В качестве контроля использовали раствор Хенкса и среду LB. Оценку типа клеточной гибели нейтрофилов проводили методом проточной цитометрии (Facs Cali-bur, "Becton Dickinson", США). В работе использовали аннексин V-FITC (AnV) в комбинации с про-пидий йодидом (PI) ("Beckman Coulter", США). Количество живых нейтрофилов оценивали по содержанию AnV—/PI—-клеток, с первичным некрозом — AnV—/PI+-клеток; ранним апоптозом — AnV+ZP^-клеток [7].
Продукцию внутриклеточных АФК нейтрофи-лами оценивали с использованием 2',7'-дигидро-дихлорфлуоресцеин ацетата в течение 90 мин. Замеры проводили каждые 15 мин на мультиплан-шетном ридере Synergy H1 ("BioTec") [8]. Результаты представлены в относительных флуоресцентных единицах как процент от максимума флуоресценции, наблюдаемой в ответ на 5 мкМ 4-форбол-12-миристат-13-ацетат (ФМА, "Sigma"). Удельную продукцию АФК рассчитывали с учетом AnV/PI- и AnV+/PI—-клеток после 30 мин контакта.
Статистическую обработку проводили с помощью парного i-критерия Стьюдента с использованием программы Statistica 6.0.
Мы обнаружили, что содержание пиоцианина, пиовердина — экзометаболитов, продуцируемых только P. aeruginosa, и экзополисахаридов, источником которых могут быть оба вида бактерий, — было ниже в супернатанте смешанной культуры, чем в моноварианте с P. aeruginosa (табл. 1). Подобный эффект, вероятно, связан с тем, что рост
E. coli в смешанной культуре стимулирует образование индола, ингибирующего работу системы кворума P. aeruginosa, с которой связана продукция пиоцианина [9].
Установлено, что супернатанты культур P. aeruginosa и E. coli достоверно снижали количество жизнеспособных нейтрофилов (AnV/PI). При воздействии супернатантов, полученных при совместном росте P. aeruginosa и E. coli, число AnV/PI-нейтрофилов не только не изменялось по сравнению с контролем (культивирование в растворе Хенкса и среде LB), но и было достоверно выше по сравнению к клеткам, которые инкубировали с супернатантами моновидовых культур (рис. 1а).
Для оценки механизмов, приводящих к снижению жизнеспособности нейтрофилов, было изучено влияние различных супернатантов на процессы первичного некроза и апоптоза. Установлено, что доля клеток, подвергшихся цитолитиче-скому действию (Ап^/Р1+-клетки), была достоверно выше только при воздействии супернатантов P. aeruginosa (рис. 1б). Некроз нейтрофилов в данном случае может быть обусловлен мембраноповре-ждающим действием дирамнолипида, фосфолипа-зы [10], а также и пиоцианина [11]. Достоверное снижение в составе смешанных супернатантов пиоцианина, который связан с рамнолипидом кворумзависимым механизмом [12], по-видимому, явилось основной причиной их низкого цито-литического эффекта (табл. 1).
Количество нейтрофилов в стадии раннего апоптоза после воздействия всех исследуемых су-пернатантов не отличалось от контроля (рис. 1в). Отсутствие проапоптотического влияния пиоцианина [2], возможно, обусловлено его отсроченным действием на морфологические перестройки нейтрофилов. Кроме этого известно, что апоптоз нейтрофилов обратимо ингибируется железо-хе-латирующими агентами [13]. Не исключено, что пиовердин, обладающий способностью связывать железо, способен оказывать сходное воздействие. Обращает на себя внимание более высокий уровень АпУ+/Р1--нейтрофилов при воздействии супернатанта E. coli, чем P. aeruginosa, что, по-видимому, связано с присутствием в бесклеточных
112
КУЗНЕЦОВА и др.
AnV /PI -клетки, %
100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0
П (a)
p-p Среда P. aeru- E. coli P. aeru-Хенкса LB ginosa ginosa +
+ E. coli
AnV/PL-клетки, % 30
25 20 15 10 5
(б)
p-p
Хенкса
Среда LB
P. aeru-ginosa
E. coli
AnVVPL-клетки, % 8
P. aeru-ginosa + + E. coli
(в)
p-p
Хенкса
Среда LB
P. aeru-ginosa
E. coli
P. aeru-ginosa + + E. coli
Продукция АФК, % от максимума 50
45 40 35 30 25 20 15 10
.......i 4
____о----
-------о_I_I_L
___о
>— —
_______о-
___,___о
Рис. 1. Количество живых (а), некротических (б) и апоптотических (в) нейтрофилов человека при действии супернатантов смешанной и моновидовых культур Р. aeruginosa и E. coli. * — p < 0.05.
фильтратах E. coli индукторов P42/44 митогенак-тивированной киназы нейтрофилов, участвующей в регуляции стресс-индуцированного апоптоза [14].
При оценке действия супернатантов на внутриклеточный уровень АФК нейтрофилов установлено, что он существенно возрастает во всех вариантах, но ниже индуцированного ФМА (рис. 2). Супернатанты смешанной культуры стимулировали окислительную активность сильнее, чем бесклеточные фильтраты P. aeruginosa, но не
0 15 30 45 60 75 90
Время, мин
Рис. 2. Продукция активных форм кислорода нейтро-филами при действии супернатантов смешанной и моновидовых культур P. aeruginosa и E. coli; 1 — раствор Хенкса, 2 — супернатант P. aeruginosa, 3 — супер-натант E. coli, 4 — супернатант P. aeruginosa + E. coli; *-P(2—4) < P(1—2; 1-3; 1-4) < °.°5.
E. coli, что, по-видимому, связано с более высоким количеством жизнеспособных нейтрофилов (рис. 1а). Так, при расчете удельной продукции АФК в нейтро
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.