ХИМИЧЕСКАЯ ФИЗИКА, 2014, том 33, № 1, с. 47-57
ХИМИЧЕСКАЯ ФИЗИКА ^^^^^^^^^^^^ БИОЛОГИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ
УДК 577.322.75
ВЛИЯНИЕ СВОБОДНОРАДИКАЛЬНОГО ОКИСЛЕНИЯ НА СТРУКТУРУ И ФУНКЦИЮ ПЛАЗМЕННОГО ФИБРИНСТАБИЛИЗИРУЮЩЕГО ФАКТОРА
© 2014 г. М. А. Розенфельд*, А. В. Бычкова, А. Н. Щеголихин, В. Б. Леонова, М. И. Бирюкова, Е. А. Костанова, С. Д. Разумовский, М. Л. Константинова
Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля Российской академии наук, Москва,
Email: markrosenfeld@rambler.ru Поступила в редакцию 14.12.2012
Плазменный фибринстабилизирующий фактор (pFXIII) является гетеросубъединичным белком, основная функция которого состоит в ковалентной стабилизации матрицы фибрина. В работе исследовали инициированное озоном свободнорадикальное окисление плазменного фибринстабили-зирующего фактора на различных стадиях его ферментативной активации. Электрофоретические данные по накоплению у—у-димеров и а-полимеров в процессе образования стабилизированного фибрина указывают на то, что снижение ферментативной активности ЕХШа в большой степени зависит от стадии активации pFXIII, на которой осуществляется окисление. Результаты УФ-, ИК-спектроскопии и спектроскопии комбинационного рассеяния свидетельствуют о том, что процесс окисления аминокислотных остатков полипептидных цепей pFXIII затрагивает прежде всего циклические, цистеиновые и цистиновые группы с образованием кислородсодержащих продуктов и сопровождается нарушением вторичной структуры белка. Методом динамического светорассеяния обнаружено разрыхление структуры белка при свободнорадикальном окислении. С помощью ЭПР-спектроскопии спиновых меток сделан вывод о локальном изменении конформации pFXIII в результате окислительной модификации. Обсуждаются возможные причины различной чувствительности pFXIII к окислительной модификации в процессе его ферментативной активации. Предполагается, что регуляторные субъединицы FXIII-£2 могут являться антиоксидантными структурными элементами белка, обеспечивающими защиту каталитических субъединиц FXIII-^2 от действия активных форм кислорода.
Ключевые слова: плазменный фибринстабилизирующий фактор, окисление, структура, химическая трансформация, ферментативная активность.
Б01: 10.7868/80207401X14010099
Плазменный фибринстабилизирующий фактор (рЕХШ) принадлежит к семейству трансглу-таминаз (эндо-у-глутамин: е-лизин трансфераза, КФ. 2.3.2.13) и является одним из ключевых белков системы свертывания крови. Подобно другим факторам свертывания рЕХШ циркулирует в плазме крови в виде неактивного профермента. Его содержание в плазме крови составляет в среднем около 20 мкг/мл [1]. Он представляет собой гетеротет-рамер (ЕХШ-А2Б2) с молекулярной массой 320 кДа, состоящий из двух идентичных одноцепочечных каталитических субъединиц А (ЕХШ-А2) с молекулярной массой субъединицы, равной ~ 83 кДа, и двух идентичных одноцепочечных регуляторных субъединиц В (ЕХШ-Б2) с молекулярной массой субъединицы ~73 кДа, удерживаемых вместе слабыми, нековалентными связями [2]. Активация фактора рХ111 осуществляется в несколько стадий. Первой стадией этого процесса, катализируемого тромбином, является гидролитическое рас-
щепление пептидной связи между Аг§37 и С1у38 в МИ2-концевой области субъединицы А, обусловливающее удаление от каждой субъединицы А ак-тивационного пептида АР. Фибринстабилизирующий фактор ЕХ111-А2Б2 превращается в фактор ЕХШ-Л2Б2, который по-прежнему не обладает ферментативной активностью [3]. Вторая стадия активации требует наличия ионов кальция, способных вызвать диссоциацию гетеросубъединиц с образованием ЕХШ-Л 2 и ЕХШ-Б2. На последней стадии процесса, также протекающего в присутствии Са2+, ЕХШ-Л '2 подвергается конформацион-ным превращениям, что обусловливает экспонирование активного центра Суз314 с формированием
фермента ЕХШ-Л * (ЕХШа) [4].
Основная функция фактора рХ111 заключается в поддержании гемостаза путем ковалентной стабилизации фибринового сгустка, сопровождающейся увеличением его механической прочности
и устойчивости к плазминовой деградации. В присутствии активной формы фибринстабилизи-рующего фактора фибриновые полимеры подвергаются ковалентному сшиванию посредством образования е/у-глутамил-лизиновых изопептидных связей [5]. При этом СООН-терминальные участки у-цепей контактирующих периферических D-областей молекул мономерного фибрина связываются ковалентно между собой с образованием межмолекулярных у—у-димеров [6]. Фактор Х111а катализирует также образование изопептидных связей между а-цепями соседних молекул фибрина таким образом, что а-цепь одной молекулы взаимодействует с а-цепями двух других молекул, обусловливая появление а-полимеров, объединяющих более пяти полипептидных а-цепей фибрина [7].
Каталитическая функция ЕХШ-Л* в настоящее время хорошо изучена. Менее очевидна роль некаталитических субъединиц В. Полагают, что в кровотоке эти субъединицы являются носителями каталитических субъединиц РХШ-Л2, защищая их от возможной протеолитической деградации и поддерживая тем самым необходимый уровень зимогена в кровотоке [8]. Кроме того, они выполняют регуляторную функцию, контролируя процесс активации РХШ-Л2В2 тромбином [9]. Так как все известные зимогены фибринстабили-зирующего фактора клеточного происхождения содержат только каталитическую субъединицу Л, полагают, что субъединица В может служить в качестве ингибитора активации субъединицы Л в плазме [10].
Известно, что многие белки, циркулирующие в плазме крови, являются мишенью для активных форм кислорода (АФК), что обуславливает процессы их свободнорадикального окисления [11]. Свободнорадикальное окисление белков может сопровождаться расщеплением полипептидных цепей, модификацией аминокислотных остатков и превращением белков в дериваты, высокочувствительные к протеолитической деградации [12]. Белки, подвергнутые окислительной модификации, накапливаются в организме с возрастом, при окислительном стрессе и целом ряде заболеваний [13]. Свободнорадикальное окисление оказывает влияние на функциональную активность белков системы свертывания крови, что способствует нарушению баланса между процессами тромбо-образования и фибринолиза [14]. Как показано, чувствительными к АФК являются фибриноген, факторы V, VIII, X, рХ111, белки фибринолитиче-ской системы [15—18]. Цель настоящей работы заключалась в изучении влияния свободноради-кального окисления на структурно-функциональные свойства плазменного фибринстабили-зирующего фактора на различных стадиях его активации.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Свободнорадикальное окисление фибринста-билизирующего фактора инициировалось озоном по методу, детально описанному ранее [19]. Количество окислителя составляло 2 • 10-7 моль.
Фибринстабилизирующий фактор был получен из плазмы крови методом дробного осаждения сульфатом аммония с последующей ионообменной хроматографией с использованием сорбента DEAE-Toy Pearl M650 (Япония) [20]. Для перевода pFXIII в активную форму ЕХШа использовали тромбин в присутствии ионов кальция ("Roche", Франция), как описано ранее [21]. Окислению подвергался фибринстабилизирующий фактор на различных стадиях его активации: исходный фактор pFXIII (образец 1), обработанный тромбином (образец 2), pFXIII в присутствии 5 мМ Са2+ (образец 3) и фактор FXII^, полученный путем активации pFXIII тромбином в присутствии 5 мМ Са2+ (образец 4). После окисления pFXIII образцы 1—3 переводили в активную форму — FXIIfe.
Методом электрофореза невосстановленных образцов в 7.5%-ном полиакриламидном геле (ПААГ) в присутствии мочевины и додецилсуль-фата натрия было выявлено, что полипептидные цепи субъединиц A и B окисленного и неокислен-ного фибринстабилизирующего фактора характеризуются значениями молекулярных масс, соответствующих нативному белку. Это указывает на отсутствие как межмолекулярных ковалентных сшивок, так и внутрицепочечной фрагментации при окислении (рис. 1). Для перекрестного сшивания полипептидных цепей фибрина использовался фибриноген, полученный из цитратной плазмы крови [22]. Ковалентное сшивание цепей фибрина, катализируемое различными образцами фактора XIIIa, осуществлялось в 0.05 М трис-HCl буфере (рН 7.4), содержащем 0.15 М NaCl и 5 • 10-3 М CaCl2. К 1 мл фибриногена с концентрацией 2 мг/мл добавляли 0.05 мл раствора тромбина (0.25 ед. NIH) и 0.01 мл фактора XIIIa. Реакцию перекрестного сшивания останавливали через 15 мин путем добавления смеси 7 М мочевины и 2%-ного доде-цилсульфата натрия. Наличие ковалентного сшивания полипептидных цепей стабилизированного фибрина, образованного под действием фактора XIIIa, определяли методом электрофореза восстановленных образцов в 7.5%-ном ПААГ в присутствии 1%-ного ß-меркаптоэтанола.
Спектры в ультрафиолетовой области белков до и после озонирования записывали на спектрофотометре СФ-2000 (Россия). Исследование состава функциональных групп проводилось на фу-рье-ИК-спектрометре Tensor-27 фирмы "Bruker" (США). ИК-спектры записывали в интервале 4000—400 см-1 при оптическом разрешении 4 см-1. Образцы для измерения были приготовлены путем
A B
>500000
95000 83000 73000 66000 55000
47500
а„
Y—Y
а
3
4
5
6
7
8
Рис. 1. Данные электрофореза восстановленных образцов фибрина: 1 — полипептидные цепи нестабилизированного фибрина; 2—5 — полипептидные цепи фибрина, образованного в присутствии соответственно неокисленного FXII^; FXH^, полученного активацией окисленного pFXIII; FXH^, полученного активацией окисленного FXIII-A2 B2; FXH^, полученного из окисленного в присутствии Са2+ pFXIII; окисленного FXIIto.
нанесения 5—10 мкл раствора белков на поверхность кремневой пластины (2 х 2 х 0.1 см) с последующим их испарением при комнатной температуре в среде азота, чтобы исключить окисление образцов примесными количествами АФК, содержащимися в атмосфере. ИК-спектры полностью высушенных белков записывали в режиме "на пропускание", накапливая 256—512 сканов на спектр с использованием приставки Micro Focus ("Perkin Elmer", Англия), оснащенной линзой из CaF2.
Спектры комбинационного рассеяния (КР) в интервале 3600—100 см-1 с разрешением 5—8 см-1 регистрировали с помощью КР-микроскопа Se
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.