научная статья по теме ВЛИЯНИЕ ТОЧЕЧНЫХ ЗАМЕН В МИНИМАЛЬНОМ ДНК-СВЯЗЫВАЮЩЕМ ДОМЕНЕ ФАКТОРА ПИГМЕНТНОЙ КСЕРОДЕРМЫ А НА ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ С ДНК-ИНТЕРМЕДИАТАМИ ЭКСЦИЗИОННОЙ РЕПАРАЦИИ НУКЛЕОТИДОВ Химия

Текст научной статьи на тему «ВЛИЯНИЕ ТОЧЕЧНЫХ ЗАМЕН В МИНИМАЛЬНОМ ДНК-СВЯЗЫВАЮЩЕМ ДОМЕНЕ ФАКТОРА ПИГМЕНТНОЙ КСЕРОДЕРМЫ А НА ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ С ДНК-ИНТЕРМЕДИАТАМИ ЭКСЦИЗИОННОЙ РЕПАРАЦИИ НУКЛЕОТИДОВ»

БИОХИМИЯ, 2014, том 79, вып. 6, с. 693 - 704

УДК 577.24

ВЛИЯНИЕ ТОЧЕЧНЫХ ЗАМЕН В МИНИМАЛЬНОМ ДНК-СВЯЗЫВАЮЩЕМ ДОМЕНЕ ФАКТОРА ПИГМЕНТНОЙ КСЕРОДЕРМЫ А НА ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ С ДНК-ИНТЕРМЕДИАТАМИ ЭКСЦИЗИОННОЙ РЕПАРАЦИИ НУКЛЕОТИДОВ

© 2014 Е.А. Мальцева1, Ю.С. Красикова1, Х. Наегели2, О.И. Лаврик1, 3, 4, Н.И. Речкунова1, 3*

1 Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, 630090 Новосибирск, просп. Лаврентьева, 8; факс: (383)333-3677, электронная почта: nadyarec@niboch.nsc.ru

2Institute of Pharmacology and Toxicology, University of Zurich-Vetsuisse, 8057Zurich, Switzerland

3 Новосибирский государственный университет, 630090 Новосибирск, ул. Пирогова, 2 4 Алтайский государственный университет, 656049 Барнаул, просп. Ленина, 61

Поступила в редакцию 19.11.13 После доработки 20.12.13

Фактор пигментной ксеродермы А (ХРА) — один из ключевых белков процесса эксцизионной репарации нуклеотидов (NER). Проведен анализ влияния точечных замен в ДНК-связывающем домене ХРА — положительно заряженные остатки лизина заменены отрицательно заряженными остатками глутамата: XPA K204E, K179E, K141E и K141/179E (двойной мутант) — на взаимодействие белка с ДНК-структурами, моделирующими интермедиаты процесса NER на стадии узнавания повреждения и формирования предрас-щепляющего комплекса. Введение аминокислотных замен, в целом, снизило сродство мутантных белков к исследованным ДНК, величина эффекта зависела от произведенной замены и структуры ДНК. Все мутанты, как и белок дикого типа, с наибольшей эффективностью связывали частично открытый поврежденный ДНК-дуплекс, сродство к которому снижалось в ряду: K204E > K179E >> K141E = K141/179E. Снижение уровня связывания мутантных белков с полным ДНК-дуплексом и одноцепочечной ДНК было более существенным, чем с ДНК, содержащей «пузырь», причем разница в сродстве возрастала по мере общего снижения ДНК-связывающей активности мутанта. Методом фотоиндуцированных пришивок к остатку 5-йодо-dUMP в различных положениях поврежденной цепи частично открытого ДНК-дуплекса показано, что ни одна из исследованных замен в ХРА не влияет на расположение белка на ДНК. Полученные результаты вместе с данными литературы позволяют предположить отсутствие прямой корреляции между сродством ХРА к ДНК и влияния фактора на процесс репарации.

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: эксцизионная репарация нуклеотидов, мутантные формы XPA, комплексообразование.

Эксцизионная репарация нуклеотидов (nucleotide excision repair, NER) — один из основных механизмов репарации ДНК. Этот процесс обеспечивает удаление широкого спектра повреждений, нарушающих двойную спираль ДНК, например: пиримидиновых димеров, образующихся под действием УФ-света, или объемных

химических аддуктов, возникающих в результате воздействия факторов окружающей среды либо при химиотерапевтическом воздействии. Одним из ключевых факторов процесса МЕЯ является белок ХРА. Известно, что пациенты с мутациями в гене, кодирующем этот белок (ХРА-пациенты), страдают одной из наиболее тяже-

Принятые сокращения: NER — эксцизионная репарация нуклеотидов (nucleotide excision repair); Flu-dUMP — 5-{3-[6-(карбоксиамидо-флуоресцеинил)амидокапромоил]аллил1}-2'-дезоксиуридин-5'-монофосфат; 5I-dUMP — 5-йодо-2'-дезоксиуридин-5'-монофосфат; RPA — репликативный белок А; XPA — фактор Xeroderma pigmentosum комплементацион-ной группы А; MDB-домен — минимальный домен связывания с ДНК (minimal DNA binding domain); ЭФ — электрофорез; н.о. — нуклеотидные основания; а.о. — аминокислотный остаток.

* Адресат для корреспонденции.

лых форм пигментной ксеродермы [1]. Инактивация ХРА приводит к практически полному подавлению процесса репарации [2]. Несмотря на многочисленные исследования, в настоящее время остается непонятным, какую конкретно роль играет XPA в процессе NER. Известные факты и основанные на них предположения противоречивы — от возможного участия в первичном узнавании повреждения [3, 4] до роли «шарнира», обеспечивающего взаимодействие между другими участниками процесса [5]. Полученные нами недавно данные по взаимодействию ХРА с ДНК, моделирующими интерме-диаты NER на стадии формирования предрас-щепляющего комплекса [6], в совокупности с результатами, демонстрирующими взаимодействие этого белка с другими факторами NER [7—11], позволяют предположить ключевую роль XPA в сборке предрасщепляющего комплекса и обеспечении правильного позиционирования белков, формирующих этот комплекс.

XPA (31 кДа, 273 а.о.) — небольшой Zn-свя-зывающий белок, способный формировать го-модимер [12]. ^-концевая часть (1—97 а.о.) XPA содержит сайт взаимодействия со средней субъединицей RPA (р32) и субъединицей ERCC1 структурно-специфичной эндонуклеазы ERCC1-XPF [7-10]. С-Концевой домен ХРА (226-273 а.о.) связывается с фактором TFIIH [11]. Центральная часть XPA (98-219 а.о.) является минимальным участком, необходимым для связывания с ДНК (MDB-домен, minimal DNA binding domain) [13] (рис. 1). C помощью ЯМР выявлено, что MDB-домен состоит из двух субдоменов: Zn-связывающего мотива (D101-K137) и участка, богатого петлями (L138-F219) [14]. Для связывания с ДНК необходимо наличие обоих суб-

доменов [13]. В ^-концевой части МЮВ-домена находится «цинковый палец» С4-типа (С105-Х-Х-С108-(Х)17-С126-Х-ХС129), участвующий в связывании с ДНК и с большой субъединицей RPA (р70) [7, 13]. Замена остатков цистеина (105, 108, 126 и 128) на серин приводит к уменьшению ДНК-связывающей активности ХРА [11]. С-Концевая часть ХРА содержит р-складку из трех цепей, 3 петли и 3 а-спирали. Структурные элементы этой части уложены таким образом, что в результате образуется «щель» с положительно заряженной поверхностью. Заряд обусловлен наличием высококонсервативных положительно заряженных аминокислот К141, К145, К151, К179, К204 и R207 [15, 16]. Размеры и кривизна «щели» подходят для связывания одно- и двухцепочечной ДНК. По-видимому, связывание ХРА с ДНК главным образом осуществляется через электростатические взаимодействия между заряженными группами этих аминокислот и фосфатными группами ДНК [16]. Расстояние между соседними положительно заряженными аминокислотными остатками 5—12 А, что сравнимо с расстоянием между фосфатными группами в одноцепочечной ДНК (5—8 А). Исходя из структуры этого участка, предполагается, что в прямом контакте с ХРА участвуют 8—9 нуклеотидов. Структура комплекса ХРА—ДНК может быть дополнительно стабилизирована гидрофобными взаимодействиями между ^-кон-цевым участком и гетероциклическими основаниями в одноцепочечной ДНК [16].

Для более детального изучения роли консервативных положительно заряженных аминокислот в структуре МЮВ-домена в связывании ХРА с ДНК с помощью сайт-направленного мутагенеза были созданы мутантные формы белка, со-

98 219 1 58 72 84 | ^5 129 153 176 1 2|6 2|3 ^ | 1 1 ill 1 1 1 Ii i

RPA (p32) ERCC1 «Цинковый палец» -М RPA(p70) TFIIH

Минимальный ДНК-связывающий домен (MDB-домен)

Рис. 1. Доменная структура XPA

держащие единичные замены остатков лизина и аргинина на нейтральные остатки глицина или отрицательно заряженные остатки глутамата [17]. Показано, что ни одна из единичных замен не приводит к существенному снижению активности белка в репарации ДНК. Значительное снижение эффективности репарации наблюдалось лишь при одновременной замене двух соседних консервативных аминокислот. Наиболее существенное уменьшение эффективности репарации отмечено при замене остатков лизина в положениях 141 и 179 на глутамат. В этом случае эффективность репарации составляла -40% по сравнению с белком XPA дикого типа, что сопоставимо c уровнем репарации при замене в гене XPA кодона R207 на стоп-кодон. Известно, что такая мутация приводит к тяжелой форме пигментной ксеродермы [18]. Любые другие комбинации двойных мутаций, в которых были задействованы K141 и K179, приводили к меньшему влиянию на эффективность репарации. С помощью иммуноблоттинга было показано, что в фибробластах XPA все мутантные формы белка экспрессировались в сопоставимом количестве [17]. Таким образом, пониженный уровень репарации является следствием внесенных замен и может быть связан со снижением сродства му-тантных форм белка к ДНК за счет электростатического отталкивания отрицательно заряженных аминокислот в MDB-домене XPA и сахаро-фосфатного остова ДНК. Кроме того, мутации в ДНК-связывающем участке белка могут влиять на топографию ДНК-белкового комплекса. В данной работе мы изучали влияние замен K141E, K179E, K204E и K141E/K179E в ДНК-связывающем домене ХРА на взаимодействие белка с различными структурами ДНК, моделирующими интермедиаты процесса NER на стадии узнавания повреждения и формирования предрасщепляющего комплекса.

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе использовали следующие материалы и реактивы: [у-32Р]АТР (3000 Ки/ммоль) производства Лаборатории радиохимии Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, полинуклеотидкиназа фага Т4 («Биосан», Россия), бензоназа («Novagen», США), окрашенные маркеры молекулярной массы белков («BioRad», США), реактивы для электрофо-резов и основные компоненты буферов фирмы «Sigma», США или отечественного производства с квалификацией осч.

Олигонуклеотиды, содержащие фотоактивный аналог 5-ldUMP и/или флуоресцеиновое произ-

водное dUMP, были синтезированы В.Н. Силь-никовым («Нанотех-С», Россия). Структуры олигонуклеотидов и аналогов нуклеотидов приведены на рис. 2.

Препараты белков. Рекомбинантный XPA человека, содержащий полигистидиновый фрагмент на ^-конце, был экспрессирован в E. coli (штамм BL21(DE3)LysS) с использованием ре-комбинантной плазмиды pET15b-XPA, любезно предоставленной Орландо Шерером (SUNY Stony Brook, USA). Клетки разрушали ультразвуком и после центрифугирования осветленный лизат наносили на колонку с модифицированной хелатным комплексом никеля NTA-агарозой, уравновешенную буфером А (50 мМ К-фосфат, рН 7,8, 0,1 М KCl, 0,01%-ный NP-40, 0,5 мМ PMSF и 10%-ный глицерин) с 5 мМ имидазо-лом. Целевой белок элюировали 100 мМ имида-золом в буфере А, элюат собирали по фракциям, фракции, содержащие основное количество белка, объединяли. В объединенную фракцию добавляли 1/3 объе

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком