научная статья по теме ВЛИЯНИЕ ТРЕГАЛОЗЫ НА ВЫДЕЛЕНИЕ КИСЛОРОДА И ПЕРЕНОС ЭЛЕКТРОНА В КОМПЛЕКСАХ ФОТОСИСТЕМЫ 2 Химия

Текст научной статьи на тему «ВЛИЯНИЕ ТРЕГАЛОЗЫ НА ВЫДЕЛЕНИЕ КИСЛОРОДА И ПЕРЕНОС ЭЛЕКТРОНА В КОМПЛЕКСАХ ФОТОСИСТЕМЫ 2»

БИОХИМИЯ, 2015, том 80, вып. 1, с. 79 - 86

УДК 577.355.3

ВЛИЯНИЕ ТРЕГАЛОЗЫ НА ВЫДЕЛЕНИЕ КИСЛОРОДА И ПЕРЕНОС ЭЛЕКТРОНА В КОМПЛЕКСАХ ФОТОСИСТЕМЫ 2*

© 2015 М.Д. Мамедов12**, И.О. Петрова1, Д.В. Яныкин2, А.А. Заспа1, А.Ю. Семенов1,3

1 Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского, 119991 Москва; факс: +7(495)939-3181, электронная почта: mahirmamedov@yandex.ru

2 Институт фундаментальных проблем биологии РАН, 142290 Пущино Московской обл.; факс: +7(496)733-0532, электронная почта: ya-d-ozh@rambler.ru

3 Институт химической физики им. Н.Н. Семенова РАН, 119991 Москва; факс: +7(495)651-2191, электронная почта: semenov@genebee.msu.ru

Поступила в редакцию 14.07.14 После доработки 02.09.14

Пигмент-белковый комплекс фотосистемы 2 (ФС2) катализирует светозависимое окисление молекулы воды и восстановление пластохинона. В этой работе было изучено влияние уникального по своим физико-химическим характеристикам дисахарида трегалозы на изолированные комплексы ФС2. Показано, что трега-лоза значительно стимулирует стационарную скорость выделения кислорода. При изучении кинетики спада флуоресценции в ответ на единичные вспышки света нами было продемонстрировано, что трегалоза не влияет на кинетику окисления первичного хинонного акцептора Q-, но увеличивает относительную долю реакционных центров ФС2, способных окислять Q-. Трегалоза также предотвращает инактивацию при длительном хранении образцов ФС2. Предположено, что в присутствии трегалозы в результате изменения гидратации комплекс ФС2 переходит в конформацию, более оптимальную для эффективного функционирования.

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: фотосистема 2, комплекс окисления воды, выделение кислорода, трегалоза, флуоресценция хлорофилла, окисление пластохинона.

Основным источником энергии в биосфере является солнечный свет. Однако лишь организмы, осуществляющие оксигенный фотосинтез, способны преобразовывать энергию фотонов, испускаемых солнцем, в энергию химических связей углеводов, расщепляя воду на молекулярный кислород с образованием восстановительных эквивалентов (электронов и протонов). Пигмент-белковый комплекс фотосистемы 2 (ФС2), погруженный в мембраны тилакоидов цианобактерий и хлоропластов, функционирует как светозависимая Н20-пластохинон оксидо-

Принятые сокращения: ФС2 — фотосистема 2; РЦ — реакционный центр; Р680 — первичный донор электрона; Qa и QB — первичный и вторичный хинонные акцепторы; YZ — редокс-активный тирозин 161 белка D1; Хл — хлорофилл; ДХММ — 3-(3,4-дихлорофенил)-1,1-диметилмоче-вина; КОВ — комплекс окисления воды.

* Первоначально английский вариант рукописи был опубликован на сайте «Biochemistry» (Moscow), Papers in Press, BM14-208, 28.12.2014.

** Адресат для корреспонденции.

редуктаза [1, 2]. Все органические и неорганические редокс-кофакторы, участвующие в реакциях переноса заряда, локализованы на Б1- и Б2-субъединицах реакционного центра (РЦ). Мп4Са05-кластер наряду с его координирующими аминокислотными остатками и четырьмя молекулами воды образует каталитический сайт, где происходит окисление молекулы воды [3—7]. Следует отметить, что комплекс окисления воды (КОВ), который расположен на донорной стороне фермента, является наиболее лабильным сайтом в ФС2 и подвержен окислительному повреждению.

Биосинтез осмолитов, участвующих в стабилизации биологических макромолекул, — древнейшая эволюционная находка природы ([8—13] и ссылки в них). В присутствии этих небольших молекул фотосинтетические организмы способны более эффективно противостоять разным стрессовым воздействиям. В качестве осмолитов могут выступать разные сахара, по-лиолы, аминокислоты, их производные и т.д. В

последние годы большое внимание уделяется трегалозе, которая естественным образом вырабатывается некоторыми видами эубактерий, ар-хей, грибов, беспозвоночных и низших растений [14, 15].

Особые физико-химические характеристики трегалозы, такие как относительная инертность гликозидной связи, существование как в кристаллическом, так и в аморфном состояниях, термостабильность (температура плавления 203°), высокая температура стеклования, высокая стабильность в широком диапазоне рН (3,5—10), высокая гидрофильность (растворимость в воде — 68 г на 100 мл), выделяют ее из ряда других ос-молитов, таких как сахароза или глицерин.

Защитный эффект трегалозы по отношению к фотосинтетическому аппарату при абиотических стрессах (обезвоживание, высокая соленость и тепловой стресс) был продемонстрирован на примере трансгенных растений ([16, 17] и ссылки в них). Ранее было показано, что трега-лоза предотвращает удаление растворимого пластоцианина из тилакоидного люмена при замораживании—оттаивании образцов [18]. Было также показано, что трегалоза защищает мембранные фрагменты ФС2 и мембраны хлороплас-тов при длительных и кратковременных замораживаниях [19]. Следует отметить, что сопряжение между переносом электрона и динамикой белка было подробно исследовано на фотосинтетических бактериальных реакционных центрах, включенных в стеклообразные матрицы с трегалозой [10, 20]. Эти данные свидетельствуют о том, что конформационные изменения, стабилизирующие разделение зарядов между фото-окисленным первичным донором электрона (Р870+) и восстановленным первичным хинон-ным акцептором (Р-), происходят вблизи Ра -связывающего сайта белка.

В настоящей работе изучалось влияние тре-галозы на реакции переноса электронов внутри белкового матрикса ФС2 из шпината. Полученные данные показывают, что этот дисахарид значительно стимулирует активность комплекса окисления воды ФС2 и предотвращает инактивацию белка при хранении.

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Выделение ядерных комплексов и мембранных фрагментов ФС2 из шпината проводили по методике, описанной в работах Хааг с соавт. [21] и Форд и Эванс [22] соответственно.

Скорость выделения кислорода при стационарном освещении (1000 мкмоль фотонов м-1 с-1) измерялось при 25° с помощью электрода Кларка

в среде, содержавшей 25 мМ MES-NaOH (pH 6,5), 15 мМ NaCl, 10 мМ CaCl2, 1 мМ K3[Fe(CN)6] и 0,1 мМ 2,6-дихлоро-«-бензохинона.

Кинетику индукции флуоресценции образцов измеряли при помощи флуориметра FL-300 («Photon Systems Instruments», Чехия). Стационарное освещение образцов осуществлялось при 625 нм. Интенсивность света на поверхности кюветы составляла 2000 мкмоль фотонов м-1 с-1.

Для регистрации кинетики спада флуоресценции хлорофилла в ответ на насыщающие вспышки света измерительный и действующий световые импульсы генерировались с помощью диодов с излучением в красной области спектра. Длительность вспышки составляла 10 мкс. Среда инкубации содержала 25 мМ MES-NaOH (pH 6,5), 15 мМ NaCl, 10 мМ CaCl2 в отсутствие и в присутствии 1 М трегалозы. Все образцы предварительно инкубировались в темноте в течение 5 мин перед измерением.

Степень деградации белка определялась по содержанию осадка.

Кинетический анализ сигналов проводили при помощи программы Origin Program Package («OriginLabCorporation», США).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

На рис. 1 показана активность комплекса окисления воды ФС2 в стационарных условиях в присутствии трегалозы. Скорость выделения кислорода в ядерных комплексах ФС2 увеличивалась от 825 (в контрольных образцах) до 2060 мкмоль O2 (мг Хл ч)-1 в присутствии 1 М трегалозы (рис. 1, а). В случае мембранных фрагментов, обогащенных комплексами ФС2, при добавлении трега-лозы наблюдалось увеличение скорости выделения кислорода от 740 до 1340 мкмоль O2 (мг Хл ч)-1 (рис. 1, б).

После 2 мин освещения ядерных комплексов ФС2 в отсутствие трегалозы скорость выделения кислорода уменьшалась на ~35% по сравнению с исходной (рис. 1, а, кривая 1). При добавлении трегалозы уменьшение скорости выделения кислорода было менее выраженным и составляло ~10% (0,5 М трегалоза, кривая 2) и 7,5% (1 М трегалоза, кривая 3) соответственно. Аналогичный анализ кинетики скорости выделения кислорода в случае мембранных фрагментов ФС2 в отсутствие трегалозы (рис. 1, б, кривая 1) показал, что скорость выделения кислорода после 2 мин освещения образцов снижалась на ~15% по сравнению с начальной. Добавление 0,5 М трегалозы приводило к уменьшению скорости выделения кислорода всего на ~5% (рис. 1, б, кривая 2), а в присутствии 1 М

а

3 2

б

1 мин

Рис. 1. Влияние трегалозы на скорости выделения кислорода в ядерных комплексах ФС2 (а) и мембранных фрагментах ФС2 (б) в среде, содержавшей 25 мМ Mes (pH 6,5), 15 мМ NaCl, 10 мМ CaCl2, в отсутствие (1) или в присутствии 0,5 M (2) или 1 M (3) трегалозы. K3[Fe(CN)6] (1 мМ) и 2,6-дихлоро-п-бензохинон (0,1 мМ) были использованы в качестве акцепторов электронов. Концентрация хлорофилла в образцах составляла 2 мкг мл-1. Скорость выделения кислорода (мкмоль O2 (мг Хл ч)-1)) составляла в ядерных комплексах ФС2: (1) 825, (2) 1500, (3) 2060; в мембранных фрагментах ФС2: (1) 740, (2) 1030, (3) 1340. Стрелками, направленными вниз и вверх, отмечено включение и выключение света (X = 650 нм, 1000 мкмоль фотонов

с-1 м-2) соответственно

трегалозы уменьшения скорости практически не наблюдалось (кривая 3).

Полученные данные указывают на то, что трегалоза стабилизирует комплекс окисления воды. Следует отметить, что дальнейшее увеличение концентрации трегалозы было невозможно из-за ограниченной растворимости при комнатной температуре [23].

Для дальнейших исследований использовались только ядерные комплексы ФС2. Эти очищенные комплексы способны осуществлять перенос электронов от воды к терминальному хи-нонному акцептору, а также выделять кислород. Следует отметить, что скорость выделения O2 в значительной степени уменьшилась (~75% ин-гибирования) в присутствии 5 мкМ 3-(3,4-ди-хлорофенил)-1, 1-диметилмочевины (ДХММ) (данные не приведены).

Индукция флуоресценции в интактных ядерных комплексах ФС2, так же как и в случае мембранных фрагментов ФС2 [24—28], характеризуется двухфазной (OJ и JP) кинетикой. Начальная (фотохимическая) фаза OJ отражает восстановление первичного хинонного акцептора Qa, тогда как кинетика и амплитуда фазы JP являются мерой скорости и степени восстановления терминального пластохинона QB на

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком