РАДИАЦИОННАЯ БИОЛОГИЯ. РАДИОЭКОЛОГИЯ, 2013, том 53, № 6, с. 598-603
МОДИФИКАЦИЯ РАДИАЦИОННЫХ ЭФФЕКТОВ =
УДК [57+61]::539.1.04:579
ВЛИЯНИЕ ЦИСПЛАТИНА НА РАДИОЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ И ВОССТАНОВЛЕНИЕ ДРОЖЖЕВЫХ КЛЕТОК © 2013 г. Е. С. Евстратова*, В. Г. Петин
Медицинский радиологический научный центр Министерства здравоохранения России, Обнинск
Изучено влияние одновременного комбинированного действия ионизирующего излучения и цис-платина на радиочувствительность и восстановление диплоидных дрожжевых клеток при их выдерживании в непитательной среде в пострадиационный период. Показано, что независимо от концентрации цисплатина (0; 0.002; 0.01; 0.02 г/мл) радиочувствительность клеток повышалась в 1.3 раза. Способность же клеток к восстановлению в непитательной среде прогрессивно уменьшалась с повышением концентрации цисплатина, вплоть до полного ингибирования. Показано, что восстановление дрожжевых клеток после комбинированных воздействий ионизирующего излучения с химическим агентом ингибируется в основном за счет формирования большей доли необратимых повреждений. Константа восстановления, характеризующая вероятность восстановления в единицу времени, не зависела от концентрации цисплатина.
Цисплатин, ионизирующее излучение, радиочувствительность, дрожжевые клетки, восстановление. БОТ: 10.7868/80869803113060040
Одной из проблем радиобиологии и медицинской радиологии является повышенная радиорезистентность опухолевых клеток, не позволяющая подвести нужную для лечения опухоли дозу из-за поражения нормальной ткани [1]. Для преодоления этой проблемы используют химические радиосенсибилизаторы, повышающие радиочувствительность опухолевых клеток в большей степени, чем нормальных тканей [2—4]. Известно, что гибель эукариотических клеток обусловлена невосстановленными или ошибочно восстановленными двунитевыми разрывами ДНК [5, 6]. Механизм действия химических радиосенсибилизаторов связывают с ингибированием процессов пострадиационного восстановления [7—12]. Хорошо известна и изучена способность дрожжевых клеток восстанавливаться от радиационных повреждений при выдерживании клеток в пострадиационный период в непитательной среде [13]. Установлено, что механизм такого восстановления связан с репарацией двунитевых разрывов ДНК [5, 6]. Такое восстановление может вносить вклад в изменение радиочувствительности даже без выдерживания облученных клеток в непитательной среде, поскольку оно может происходить в течение времени между посевом клеток на питательную среду и завершением первого почкования дрожжевых клеток, после которого повреждения полностью фиксируются и становятся необратимыми [13]. Вклад такого восстановления был количе-
* Адресат для корреспонденции: 249036 Обнинск, Калужская обл., ул. Королева, 4, МРНЦ РАМН; тел.: (48439) 7-47-43; факс: (495) 956-14-40; e-mail: ekevs7240@mail.ru.
ственно оценен с использованием цитоплазмати-ческого мутанта, утратившего способность к восстановлению при выдерживании в воде благодаря мутации, связанной с дыхательной недостаточностью [14]. В этой работе описан метод расчета вклада эффекта восстановления, протекающего на питательной среде, в выживаемость облученных клеток, оцениваемую в эксперименте. Тем самым предложен метод оценки кривой выживаемости, характеризующей радиочувствительность клеток, немодифицированную последующими репарационными событиями. Помимо восстановления в непитательной среде, для дрожжевых клеток феноменологически выделяют диплоид-специфиче-ское восстановление, благодаря которому диплоидные клетки дикого типа намного более устойчивы к действию ионизирующего излучения, чем их гаплоидные клетки или радиочувствительные мутанты. Во многих случаях, как для дрожжевых клеток, так и для клеток млекопитающих способность клеток восстанавливаться в непитательной среде рассматривается как индикатор общей способности клеток к восстановлению [7—12]. В этих работах продемонстрировано, что способность клеток к восстановлению в непитательной среде значительно уменьшается вплоть до полного подавления с увеличением концентрации химических ингибиторов, но при этом общая радиочувствительность клеток повышается в значительно большей степени, чем можно было ожидать от ингибирова-ния только такого восстановления. Результаты, опубликованные в работах [7—12], означают, что одновременно с ингибированием восстановления
клеток в непитательной среде происходит подавление и других процессов восстановления. Другими словами, подавление такого восстановления может служить индикатором снижения эффективности и других репарационных систем. В данной работе использован цисплатин (цис-диаминди-хлорплатина, [Р1(МН3)2С12], производитель ООО "ЛЭНС-Фарм"). Этот препарат обладает свойствами, сходными со свойствами бифункциональных алкилирующих агентов, образующих в ДНК внутри- и межнитевые сшивки. Целью данной работы было изучение влияния цисплатина на радиочувствительность дрожжевых клеток и их способность к пострадиационному восстановлению.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДИКА
В опытах использовали диплоидные дрожжевые клетки Saccharomyces сerevisiae, штамм XS800. Радиобиологические характеристики этого штамма хорошо изучены [13, 15]. До облучения дрожжевые клетки культивировали на плотной питательной среде в пробирках (косяки) при 30°С до достижения ими стационарной фазы роста в течение 3—12 сут. Непосредственно перед облучением дрожжевые клетки смывали с поверхности агара небольшим объемом стерильной дистиллированной воды и доводили концентрацию суспензии до 106 кл/мл.
В пробирки с дрожжевыми клетками добавляли цисплатин различной концентрации (0.002, 0.01 и 0.02 г/мл). Клетки выдерживали в присутствии химического препарата в течение 1 ч при 30°С, далее препарат присутствовал во время облучения и после него. Для отслеживания влияния у-излучения отдельно от цисплатина использовали суспензию, не содержащую химический препарат. В качестве источника излучения в экспериментах использовали установку "Исследователь" (60Со, 23 Гр/мин). Для каждой дозы рассчитывали продолжительность воздействия с учетом дополнительного облучения при подъеме и спуске подвижной части установки.
Основным тестом, использованным в данной работе, является выживаемость, т.е. способность облученных клеток к бесконечному размножению, определяемая по их способности образовывать видимые невооруженным глазом макроколонии. Для определения выживаемости облученных дрожжевых клеток суспензию, содержащую 106 кл/мл, высеивали по 0.1 мл на поверхность твердой питательной среды в чашки Петри с таким расчетом, чтобы в каждой чашке, независимо от дозы облучения, вырастало примерно 50—200 колоний. После 3—5 сут инкубации в термостате при 30°С в чашках Петри вырастают видимые невооруженным глазом колонии.
Одним из способов обнаружения пострадиационного восстановления является выдерживание клеток в непитательной среде (воде) после облучения [13]. Облученные суспензии клеток инкубировали при температуре 30°С и после различных сроков инкубации высевали клетки на питательный агар с последующим определением выживаемости. Эксперименты выполняли в пяти повторностях.
Описание математической модели
Для описания кинетики пострадиационного восстановления клеток было использовано [13, 16] следующее уравнение:
Дэф(0 = К + (1 - К)е
-в
(1)
где D1 — первоначальная доза, в которой были облучены клетки; t — продолжительность восстановления; Dэф(t) — эффективная доза в зависимости от продолжительности пострадиационного восстановления; е — основание натуральных логарифмов; K — необратимый компонент лучевого поражения; р — константа восстановления, характеризующая вероятность восстановления от радиационных повреждений в единицу времени. Это уравнение (1) впервые было применено для описания кинетики восстановления животных [17].
После восстановления клеток в течение времени t выживаемость клеток увеличивается, т.е. уменьшается число первичных повреждений. Этому новому числу повреждений соответствует некоторая эффективная доза Dэф(t). Тогда
К( 0 =
МО
Б .
(2)
Функция включает в себя как необратимые, так и восстанавливаемые повреждения, и показывает относительную часть первичных повреждений, от которых клетки не успели (или не смогли) восстановиться к моменту времени t.
В процессе пострадиационного восстановления уменьшается за счет репарации радиационных повреждений. Если t достаточно велико, то кривая зависимости выживаемости от продолжительности восстановления выходит на плато, т.е. процесс восстановления прекращается. Для этого момента времени
К =
Бф ( плато)
Б .
(3)
Параметр K называют необратимым компонентом радиационного поражения клеток. Удобство введения этого параметра заключается в том, что его величина количественно указывает долю не-
Доза, Гр Продолжительность
восстановления, ч
Рис. 1. Кривые зависимости выживаемости дрожжевых клеток от дозы ионизирующего излучения (А) и продолжительности пострадиационного восстановления клеток в непитательной среде (Б): 1 — только ионизирующее излучение, 2 — ионизирующее излучение + цисплатин (0.002 г/мл), 3 — ионизирующее излучение + цисплатин (0.01 г/мл), 4 — ионизирующее излучение + цисплатин (0.02 г/мл).
обратимых радиационных повреждений, от которых клетки неспособны восстанавливаться. Из уравнений (1)—(3) следует, что
_ Аф(0 - Р3ф(плато)
Обозначая
А (0 =
получаем
А - Аф (плато)
Аф ( 0 - Аф ( ПЛ это )
А - Аф ( плато)
_ - 1п А ( г)
(4)
в _ -
г
(5)
(6)
Функция А(0 отражает динамику изменения относительной доли восстанавливаемых радиационных повреждений от продолжительности пострадиационного восстановления. Известно, что эта функция уменьшается по экспоненте с увеличением продолжительности восстановления [7—14, 18]. Это означает, что за одинаковый интервал времени восстанавливается одинаковая доля от числа восстанавливаемых повреждений, поэтому параметр р называют константой восстановления.
Экспериментальные кривые выживаемости, полученные сразу после воздействия только ионизирующим излучением или после его ком-
бинированного применения с химическим агентом, позволяют оценить Л1 и Лэф(?). Это, в свою о
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.