ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2012, том 59, № 2, с. 216-224
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ^^^^^^^^^^^^ СТАТЬИ
УДК 581.1
ВЛИЯНИЕ ТЯЖЕЛЫХ МЕТАЛЛОВ НА ФОТОСИНТЕТИЧЕСКИЙ АППАРАТ И АНТИОКСИДАНТНЫЙ СТАТУС ЭЛОДЕИ
© 2012 г. М. Г. Малева, Г. Ф. Некрасова, Г. Г. Борисова, Н. В. Чукина, О. С. Ушакова
Уральский государственный университет им. А.М. Горького, Екатеринбург Поступила в редакцию 01.03.2011 г.
Изучено влияние тяжелых металлов (ТМ, сульфатов Ni, Cd, Cu, Zn, Mn в концентрации 1 мкМ) при их раздельном и совместном действии на рост побегов элодеи (Elodea (Egeria) densa Planch.), структурно-функциональные параметры фотосинтетического аппарата, интенсивность перекисного окисления липидов, активность ферментов антиоксидантной защитной системы (супероксиддис-мутазы (СОД) и каталазы (КАТ)), содержание небелковых и белковых тиолов в листьях. ТМ накапливались в листьях в соотношении Mn > Cu > Cd > Zn > Ni. Наибольшее снижение содержания хло-рофиллов вызывали Mn и Cu, содержания каротиноидов - Cu. В присутствии Cu отмечали наибольшее снижение максимального квантового выхода ФС II (Fv/Fm), и при этом про-/антиоксидантное равновесие сдвигалось в сторону окислительных процессов. Cd вызывал увеличение содержания хлорофиллов и каротиноидов, но не влиял на фотохимическую эффективностью ФС II; существенно снижал прирост побегов, но слабо влиял на мезоструктуру листа. Добавление в среду второго металла в большинстве вариантов снижало негативное влияние отдельных ионов за счет усиления активности СОД и КАТ, а также значительного возрастания количества небелковых тиолов. Предположили, что наблюдаемый антагонизм ионов связан со снижением поступления ТМ в клетку в результате их конкурентного взаимодействия.
Ключевые слова: Elodea (Egeria) densa — тяжелые металлы — окислительный стресс —антиоксидант-ные ферменты — фотосинтетический аппарат — флуоресценция хлорофилла — небелковые и белковые тиолы
ВВЕДЕНИЕ
Проблема устойчивости высших растений к антропогенному загрязнению является одной из приоритетных в современной биологии. Среди многочисленных загрязнителей особое место занимают тяжелые металлы (ТМ). В небольших количествах многие из них необходимы для нормальной жизнедеятельности растений, например, медь, цинк, марганец и никель являются кофакторами ферментов различных биохимических реакций или входят в состав биологических комплексов [1]. Роль других, например, кадмия, не определена, однако все металлы в высоких концентрациях подавляют рост и влияют на жизнеспособность растений, нарушая физиолого-био-химические процессы в клетках [2, 3].
Сокращения: АОС — антиоксидантная система, ДТНБК — 5,5'-дитиобис(2-нитробензойная) кислота, КАТ — каталаза, НСТ — нитросиний тетразолий, РЦ — реакционный центр, СОД — супероксиддисмутаза, ТБК — тиобарбитуровая кислота, ТМ — тяжелые металлы, — максимальный квантовый выход ФС II.
Адрес для корреспонденции: Малева Мария Георгиевна. 620000 Екатеринбург, пр. Ленина, 51. Уральский государственный университет им. А.М. Горького, биологический факультет, кафедра физиологии и биохимии растений. Электронная почта: maria.maleva@mail.ru
Устойчивость растений к стрессовым факторам в значительной степени определяется их ан-тиоксидантным статусом, т.е. способностью поддерживать баланс между прооксидантными и ан-тиоксидантными реакциями, протекающими в клетке. Под действием ТМ содержание активных форм кислорода (АФК) в клетке может резко увеличиваться, что приводит к нарушению равновесия и развитию окислительного стресса [4]. Активные радикалы, главным образом, гидроксиль-
ный (ОН ), взаимодействуют с органическими молекулами: пигментами, липидами, белками, нуклеиновыми кислотами [4, 5]. В ответ на окислительный стресс в растениях активируется система антиоксидантной защиты (АОС), запускающая работу низкомолекулярных и высокомолекулярных антиоксидантов. Среди них важную роль выполняют каротиноиды, восстановленный глутатион (С8И) и основные антиоксидантные ферменты — супероксиддисмутаза (СОД) и каталаза (КАТ) [4, 5]. Некоторые авторы относят к АОС обогащенные тиолами белки и пептиды (металл отионеины и фитохелатины), которые способны не только связывать избыток ТМ, но и участвовать в нейтрализации токсичных радикалов [6].
Гидрофиты являются важными компонентами водных экосистем. Способность водных растений накапливать ТМ в значительных количествах, образуя нетоксичные комплексы [7, 8], свидетельствует об их высокой устойчивости к повышенным концентрациям металлов в среде обитания и открывает широкие перспективы для их использования при мониторинге и фитореме-диации.
В последнее время в литературе появилось много работ, посвященных влиянию отдельных ионов на развитие про- и антиоксидантных реакций в листьях водных растений [3, 7, 8], однако совместное действие двух или нескольких металлов изучено недостаточно. В природных водных экосистемах растения подвержены действию ТМ в потенциально опасных концентрациях, которые могут оказывать синергическое или антагонистическое влияние на различные физиологические показатели. Наши ранние исследования показали [9, 10], что среди ТМ, загрязняющих водные объекты Среднего Урала, преобладают медь, цинк, марганец, в ряде случаев никель и кадмий, что обусловлено как антропогенными, так и природными факторами. Загрязнение поверхностных вод этими элементами носит сложный многокомпонентный характер, обусловленный сочетанием различных ионов. Поэтому в модельных условиях совместное влияние нескольких ТМ на растения должно быть исследовано не только в аспекте их токсичности, но и с учетом характера взаимодействия. Знание физио-лого-биохимических механизмов устойчивости растений к совместному действию ионов ТМ позволит расширить представление о пластичности метаболических процессов и пределах чувствительности к ним растительных организмов.
Цель настоящей работы заключалась в выявлении влияния ТМ (Ni, Cd, Cu, Zn, Mn) при их раздельном и совместном действии на структурно-функциональные параметры фотосинтетического аппарата, интенсивность перекисного окисления липидов (ПОЛ), активность фермен-тов-антиоксидантов (СОД и КАТ) и содержание небелковых и белковых тиолов в листьях элодеи.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Объект и условия выращивания. Исследования проводили на растениях элодеи густолиственной (Elodea (Egeria) densa Planch.) из сем. Hydrochari-taceae (Водокрасовые). Этот погруженный гидрофит неприхотлив при выращивании в лабораторных условиях, не требует обязательного укоренения, быстро наращивает биомассу, поэтому часто используется в качестве модельного объекта.
Постановка эксперимента. В первой серии экспериментов побеги элодеи длиной 6-10 см инку-
бировали в течение 4 суток на 5% среде Хогланда-Арнона I (1 л среды содержал 41 мг безводного Ca(NO3)2, 25 мг KNO3, 6.8 мг KH2PO4, 12 мг MgSO4 • 7H2O) при температуре 23-25°C и естественном освещении. В опытные сосуды добавляли ТМ в форме сульфатов (1 мкМ): Ni, Cd, Cu, Zn, Mn, по отдельности и совместно: Ni + Cd, Ni + + Cu, Ni + Zn, Mn + Ni, Mn + Cd, Mn + Cu, Mn + + Zn (1 : 1). Эта концентрация была подобрана экспериментальным путем, поскольку в модельных условиях не оказывала сильного токсического действия на растения. Контролем служил вариант без добавления металлов. Среду в контрольном и опытных сосудах заменяли ежедневно, чтобы поддерживать заданную концентрацию ионов. Отобранные для анализа пробы растительного материала отмывали в течение 3 мин 0.01% раствором Na-ЭДТА, затем в течение 3-5 мин трижды промывали дистиллированной водой для удаления металлов, сорбированных на поверхности. Для физиолого-биохимических исследований брали листья среднего яруса, завершившие рост.
Во второй серии экспериментов растения элодеи выращивали в течение 68 суток при описанных выше условиях. В опытных вариантах добавляли сульфаты Ni, Cd и Mn по отдельности и совместно: Ni + Cd (1 : 1) и Ni + Cd + Cu + Zn + Mn (1 : 1 : 1 : 1 : 1) в концентрациях 1 мкМ. Контролем служили растения, выращенные без добавления металлов. Среду в контрольном и опытных вариантах еженедельно заменяли на свежую. Прирост основного побега элодеи в конце опыта рассчитывали путем вычитания исходного значения из конечной длины растения. Листья элодеи, сформированные за этот период (5-8 ярус от верхушки побегов), фиксировали в 70% этаноле для последующего определения количественных показателей мезоструктуры.
Содержание тяжелых металлов. Содержание ТМ в листьях элодеи определяли методом атом-но-эмиссионной спектроскопии на iCAP 6300 Duo ("Thermo Electron", США-Великобритания) после мокрого озоления 70% HNO3 (о.с.ч.).
Содержание фотосинтетических пигментов и флуоресценция хлорофиллов. Содержание хлоро-филлов a, b и каротиноидов определяли спектро-фотометрически на Specord M 40 ("Carl Zeiss Jena", Германия). Для этого навеску листьев (30 мг) гомогенизировали в охлажденном 80% ацетоне и центрифугировали 10 мин при 5000 g. Расчет содержания хлорофиллов и каротиноидов проводили по Lichtenthaler [11].
Параметры переменной флуоресценции хлорофилла определяли с помощью импульсного флуориметра PAM 210 ("Walz", Германия), руководствуясь инструкцией производителя [12]. Перед измерением флуоресценции листья выдерживали в темноте в течение 15 мин для минимиза-
ции тушения флуоресценции. Показатель Fv/Fm определяли для оценки максимального квантового выхода фотохимии ФС II.
Структура фотосинтетического аппарата листа.
Особенностью анатомического строения листа элодеи является тонкая листовая пластинка, состоящая всего из двух слоев клеток — верхнего и нижнего эпидермиса, которые выполняют основную фотосинтезирующую функцию. Количественную оценку структуры мезофилла листа изучали в соответствии с методикой Мокроносова и Борзенковой [13]. Для анализа брали 5-10 листьев элодеи 5-8 ярусов от верхушки побега с 5 растений. Толщину листа измеряли на поперечных срезах листьев, используя световой микроскоп Meiji Techno (Япония) и окулярный микрометр АМ-9-2 ("ГСЗ", Россия). Размеры клеток верхнего и нижнего эпидермиса (после мацерации листьев в 5% растворе хромовой кислоты в 1 N HCl), а также размеры хлоропластов (на
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.