РАДИАЦИОННАЯ БИОЛОГИЯ. РАДИОЭКОЛОГИЯ, 2012, том 52, № 5, с. 534-541
- УФ-ОБЛУЧЕНИЕ
УДК [57+61]::539.1.047:612:51.111.2:535-3
ВЛИЯНИЕ УФ-СВЕТА НА РЕЦЕПТОРНЫЙ ПРОФИЛЬ ЛИМФОЦИТОВ
ДОНОРСКОЙ КРОВИ
© 2012 г. В. Г. Артюхов1 *, О. В. Земченкова2, О. В. Башарина1, С. В. Рязанцев2
1 Воронежский государственный университет 2 Воронежская государственная медицинская академия им. Н.Н. Бурденко
Исследовано влияние УФ-света (240—390 нм) в дозах 151 и 755 Дж/м2 на содержание мембранных маркеров лимфоцитов: CD3, CD19, CD4, CD8, CD25, CD95 методом проточной цитометрии. Показано, что УФ-облучение лимфоцитов индуцирует снижение количества молекул CD3, CD4 и CD19 при одновременном повышении количества молекул CD8, CD25 в ходе суточной инкубации клеток в питательной среде без плазмы. При использовании аутологичной плазмы в ходе инкубации как нативных, так и УФ-облученных лимфоцитов процентное содержание клеток, несущих указанные маркеры, не отличается от соответствующих значений непосредственно после выделения клеток. Однако уровень экспрессии CD95 — одного из рецепторов апоптотических сигналов — повышается у фотомодифицированных клеток, инкубируемых как в присутствии, так и в отсутствие плазмы. Выявлено, что данное повышение обусловлено, главным образом, синтезом белка de novo под действием факторов, индуцирующих апоптоз.
Лимфоциты, УФ-свет, молекулы CD3, CD4, CD8, CD25, CD95.
Взаимодействием Т- и В-лимфоцитов обеспечивается специфический иммунный ответ. Взаимосвязи и взаимная регуляция этих клеток опосредованы цитокинами, а также поверхностными адгезионными и костимулирующими молекулами [1]. Общепринятым методом идентификации популяций и субпопуляций лимфоцитов является изучение экспрессии на их мембранах специфических антигенов и рецепторов, т. е. их поверхностного фенотипа, что позволяет получить количественные характеристики содержания в крови Т- и В-лимфоцитов, их субпопуляций и продуктов, судить о функциональной полноценности клеток.
Уникальными поверхностными маркерами В-лимфоцитов являются иммуноглобулиновые ан-тигенраспознающие рецепторы, некоторые кластеры дифференцировки (CD) и рецепторы В-клеточных митогенов. В-клеточный антигенрас-познающий рецептор (BCR) состоит из мембранной формы IgM и IgD и ассоциированных с ними молекул CD19 и CD20, экспрессированных на всех В-лимфоцитах [1, 2].
Антигенраспознающий Т-клеточный рецептор (TCR) — основная структура мембраны Т-лимфоцита. У Т-клеток ар-типа TCR представляет собой комплекс из восьми цепей: высоко вариабельные а- и р-цепи, невариабельные дополнительные цепи CD3y, CD3p, CD3e (CD3-комплекс)
* Адресат для корреспонденции: 394006 Воронеж, Университетская пл.,1, ВГУ; тел.: (473) 220-89-81, (473) 220-85-86; факс: (473) 220-83-08; e-mail: avg@main.vsu.ru.
в непосредственном контакте с интрацитоплаз-матическим гомодимером ^-цепей. Несколько дополнительных мембранных молекул выполняют функции корецепторных структур. В первую очередь к ним относятся молекула СЭ4, имеющая сродство к МНС II, и молекула СЭ8, обладающая сродством к МНС I [3]. На поверхности зрелого Т-лимфоцита присутствует лишь одна из этих молекул, с чем связано деление Т-клеток на две субпопуляции: СЭ4+ТЬ (хелперы) и СЭ8+СТЬ (цитотоксические клетки). Участие ко-рецепторов СЭ4 или СЭ8 существенно оптимизирует передачу сигнала активации от ТСЯ [1].
Запуск пролиферативного ответа Т-лимфоци-тов — многокаскадный процесс, в котором важную роль играет экспрессия Т-клеточного ростового фактора интерлейкина-2 (ИЛ-2) и его рецептора. В нормальных покоящихся лимфоцитах крови человека рецептор ИЛ-2 является диме-ром, состоящим из субъединиц р(СЭ122) и ус(СЭ132), способным к проведению сигнала, который индуцируется после связывания ИЛ-2 [4]. В процессе активации антигеном в Т-клетках формируется комплекс, в состав которого, помимо названных, входит а-цепь (СЭ25) [5]. Появление этой субъединицы в составе рус рецептора ИЛ-2 нормальных лимфоцитов человека приводит к возрастанию сродства рецептора к ИЛ-2. И именно взаимодействие ИЛ-2 с высокоаффинным рецептором ИЛ-2 в Т-лимфоцитах является тем ключевым моментом, который обеспечивает запуск сигнальных событий, непосредственно ре-
гулирующих вступление покоящихся Т-лимфоцитов в клеточный цикл [6]. С нарушением механизмов, контролирующих экспрессию а-субъ-единицы в Т-лимфоцитах, связано развитие ряда аутоиммунных заболеваний [7].
Для нормального протекания иммунного ответа в организме необходима сбалансированная активность взаимодействующих иммуннорегуля-торных клеток. В настоящее время фенотипиро-вание лимфоцитов имеет важное диагностическое значение при первичных и приобретенных иммунных и лимфопролиферативных заболеваниях.
Для стимуляции в организме пролифератив-ных процессов современная медицина широко использует различные методы светолечения. Наряду с активацией пролиферативных процессов излучения оптического диапазона обладают антивоспалительным, иммуномодулирующим и анальгетическим действием, улучшают микроциркуляцию, нормализуют метаболические процессы [8, 9]. Объектами непосредственного воздействия УФ-света являются все компоненты крови, в том числе иммунокомпетентные клетки. Облученная кровь при возвращении в кровяное русло активирует массу циркулирующих лимфоцитов и обладает огромным терапевтическим потенциалом [10]. Триггерным механизмом этого эффекта могут быть быстрые структурно-функциональные изменения иммуннокомпетентных клеток в небольшом объеме фотомодифициро-ванной крови, причем ключевую роль здесь играют изменения поверхностных структур моно-нуклеаров [11].
Однако сообщения о повреждающем действии УФ-излучения на клеточные элементы крови вызывают неоднозначное отношение к методу АУФОК. Известно, что УФ-свет индуцирует апо-птоз в лимфоидных клетках [12]. При УФ-облуче-нии в процессе поглощения энергии в первую очередь принимают участие компоненты мембран лимфоцитов. В то же время в работе [13] показано, что повреждения ДНК (однонитевые разрывы) обнаруживаются сразу после УФ-облуче-ния лимфоцитов в дозах 1510 и 3020 Дж/м2. Все вышеизложенное вызывает необходимость проведения исследований, касающихся изучения мо-лекулярно-клеточных механизмов реализации организменных эффектов АУФОК.
В связи с этим мы исследовали влияние УФ-света (240—390 нм) в терапевтическом диапазоне доз — 151 и 755 Дж/м2 на субпопуляционный состав лимфоцитов крови человека и уровень экспрессии молекул их рецепторных комплексов на поверхности клеточных мембран.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДИКА
Выделение лимфоцитов из периферической гепаринизированной крови здоровых доноров осуществляли путем ее центрифугирования в градиенте плотности фиколла-урографина (р = = 1.077 г/см3).
УФ-облучение лимфоцитов (2 х 106 клеток/мл) проводили при их непрерывном перемешивании магнитной мешалкой в термостатируемой кювете (20 ± 1°С) полусферической формы с помощью ртутно-кварцевой лампы типа ДРТ-400 через светофильтр УФС-1 с полосой пропускания 240— 390 нм (со спектральными линиями 253.7, 265.2, 280, 296.7, 302.2, 312.6 и 365 нм). Расстояние от оси лампы до кюветы с клетками составляло 23 см. Клетки облучали непосредственно после их выделения (и приблизительно через 1 ч после забора крови). Интенсивность облучения составляла 151 Дж/(м2 мин). Объем вносимого в кювету образца — 2 мл. Использовали дозы 151 и 755 Дж/м2 при времени облучения соответственно 1 и 5 мин. Плотность энергии излучения, создаваемую УФ-лучами, измеряли с помощью уфиметра, смонтированного на кафедре биофизики Воронежского государственного университета. В качестве теплового приемника УФ-излу-чения в уфиметре применяли термобатарею, собранную из 50 нихромово-константановых термопар.
Нативные и облученные лимфоциты инкубировали в питательной среде RPMI-1640 ("Био-лот", Россия) в отсутствие и в присутствии 18%-ной аутологичной плазмы крови и циклогекси-мида (10-4 моль/л; "Sigma", США) при температуре 37°С в атмосфере с [СО2] = 5% в течение 24 ч.
Определение количества клеток с изучаемыми маркерами на поверхности мембран нативных и фотомодифицированных лимфоцитов осуществляли методом проточной цитофлуориметрии, используя цитофлуориметр CyFlow space ("Partee"). Двойное окрашивание клеток проводили с использованием комбинаций моноклональных антител: CD3-FITC - CD19-PE, CD4-FITC - CD8-PE, CD3-FITC — CD25-PE и соответствующие изотипические контроли (все "Beckman Coulter", США). Количество анализируемых клеток было не ниже 104 и не изменялось в ходе эксперимента.
В каждой серии экспериментов число доноров составляло от 10 до 15 человек. Статистическую обработку результатов исследований проводили с помощью пакета программ Statgraphics plus 3.0. Отличия величин тестируемых показателей в контрольных и опытных сериях экспериментов оценивали с помощью метода попарной статистики, используя í-критерий Стьюдента. Различия считали достоверными прир < 0.05 [14], данные представляли как среднее значение ± доверительный интервал.
м
Рч
сл
о
о
1000 100 10 1
0.1
:13.2±3.0% Г. ?■ А
■ 67.2±4.0% ойК
0.1 1 10 100 1000 СБ3 FITC
1000 100 10 1 0.1
9.0 ± 2.0% Б
67.2 ± 3.0%
'Х'Щ^';-
1-...1 Ы1>
0.1 1 10 100 1000 СБ3 FITC
1000 100
м
Си
10
о
С
0.1
\ 5.1 ± 1.7 % В
=■ .
1 .-V-:-'
57.0 ± 2.1%
л'Ж
1000 100
м
Си
К 10 о
С
0.1
= 4.6 ± 1.5% " ■ . о ■-- ■ ' г
ЙЙ'ЯЧЧО. 52.3±2.8%
0.1 1 10 100 1000 СБ3 FITC
0.1 1 10 100 1000 СБ3 FITC
м
Рч
сл
о
С
1000 100 10
0.1
: 19.5 ± 2. : ■ „ ; - 8% Д ¿ОХАЛ;,
м
Рч
сл
О
С
1000 100 10 1 0.1
= 12.8 ± 2.1 % Е
л? .
Г ' 72.3 ± 2.9%
0.1 1 10 100 1000 СБ3 FITC
0.1 1 10 100 1000 СБ3 FITC
1000 100 10 1 0.1
Ё 13.2 ± 2.0 | »' _ ^ - . % Ж
= аЙЙЙ'^ ■ : Г'Н '-в'. -. X ' >.■"■-- . - 'Л'-- -л^64.0 ± 1.9%
0.1 1 10 100 1000 СБ3 FITC
1
Рис. 1. Распределение количества лимфоцитов по параметрам флуоресценции при окраске антителами к CD3 и CD19 УФ-облученных клеток крови здоровых доноров: А — лимфоциты непосредственно после выделения;
Б, Д — необлученные клетки, инкубируемые в течение суток в отсутствие и присутствии аутологичной плазмы соответственно;
В, Е — фотомодифицирован
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.