УДК 597:591.132.05
ВЛИЯНИЕ УСЛОВИЙ СРЕДЫ ОБИТАНИЯ НА pH-ЗАВИСИМОСТЬ ПРОТЕИНАЗ И ГЛИКОЗИДАЗ КИШЕЧНОЙ МИКРОФЛОРЫ КАРАСЯ
© 2014 г. В. В. Кузьмина*, Г. В. Золотарева**, В. А. Шептицкий**
*Институт биологии внутренних вод им. И.Д. Папанина РАН 152742 Россия, Ярославская обл., Некоузский р-н, Борок, е-ша11^к^т1па@1Ьт.уаго$1т1.ги **Приднестровский государственный университет им. Т.Г. Шевченко 3300 Молдова, Тирасполь, ул. 25 Октября, д. 107 Поступила в редакцию 02.04.2013 г.
Впервые выявлены существенные различия рН-зависимости протеолитической (ПА) и амилолитиче-ской активности (АА) энтеральной микробиоты у серебряного карася из разных мест обитания (р. Днестр и Кучурганское водохранилище). Максимум ПА у рыб, обитающих в разных водоемах, варьирует в диапазоне рН от 7 до 10, в то время как максимум АА наблюдается только при рН 7. Уровень ПА и АА у рыб из Кучурганского водохранилища, отличающего повышенной трофией и высоким уровнем бактериопланктона, значительно выше, чем у рыб из р. Днестр. Для сравнения изучено влияние рН на активность протеиназ и гликозидаз слизистой оболочки кишечника и химуса этих же рыб.
Ключевые слова: среда обитания, энтеральная микробиота, карась, протеиназы, гликозидазы, рН.
DOI: 10.7868/S0367059714040076
Известно, что состав микрофлоры пищеварительного тракта рыб в значительной мере зависит от такового в воде и пище (Buddington et al., 1997). Это обстоятельство необходимо учитывать при исследовании эффективности питания рыб, поскольку в последние десятилетия доказана важная роль симбионтного пищеварения, реализуемого энтеральной микробиотой, в деградации компонентов пищи у различных животных, в частности рыб (Уголев, 1985). В настоящее время не вызывает сомнения значительная роль энте-ральной микробиоты в гидролизе различных, в том числе специфических, компонентов пищи рыб (Лубянскене и др., 1989; Шивокене, 1989; Уголев, Кузьмина, 1993; Кузьмина, 2005). Однако вклад ферментов микроорганизмов, обеспечивающих симбионтное пищеварение, в процессы пищеварения корректно оценить невозможно (Кузьмина, 2005). Вместе с тем об их роли можно судить, используя сопоставление различных характеристик ферментов энтеральной микробио-ты, а также ферментов, функционирующих в составе слизистой оболочки кишечника и химуса.
Наиболее подробно исследованы ферменты слизистой оболочки желудка и кишечника рыб (Barrington, 1957; Fange, Grove, 1979; Кузьмина, 1996, 2005; Уголев, Кузьмина, 1993). Характеристики ферментов химуса изучены значительно слабее (Кузьмина, 2005). Вместе с тем в полости
кишечника, помимо ферментов, синтезируемых пищеварительной системой рыб и их объектами питания (Кузьмина, 1996, 2000, 2005), функционируют ферменты, синтезируемые энтеральной микробиотой (Уголев, Кузьмина, 1993; Кузьмина, 2005).
Известно, что оптимум рН протеиназ, функционирующих в составе слизистой кишечника, у большинства видов рыб находится в зоне 9—11, а-амилазы — 6.5—8.5 (Уголев, Кузьмина, 1993). Протеиназы различных микроорганизмов максимальную активность обычно проявляют при нейтральных или щелочных значениях рН (Лубянскене и др., 1989; Кузьмина, 2005). Однако при изучении влияния рН на активность пищеварительных ферментов у рыб Рыбинского водохранилища на фоне близких характеристик протеиназ слизистой и химуса (оптимум рН 10) были выявлены существенные видовые различия параметров ферментов энтеральной микробиоты — оптимум рН варьировал от 5.0 до 8.0 (Кш'шта й а1., 2011). Эти данные свидетельствовали о различиях видового состава энтеральной микробиоты. Полученные результаты позволили предположить, что в связи с различиями в составе и численности микроорганизмов из разных гидробиоценозов характеристики ферментов энтеральной микробиоты у рыб, обитающих в разных экологических условиях, могут значительно различаться. Из-за отсут-
ствия сведений о влиянии особенностей среды обитания на активность протеиназ и гликозидаз энтеральной микробиоты рыб в широком диапазоне значений рН целесообразно исследовать характеристики ферментов у рыб одного и того же вида из водоемов и водотоков, различающихся по гидрологическому режиму и состоянию кормовых ресурсов.
В связи с этим цель работы состояла в изучении влияния рН на активность протеиназ и гли-козидаз энтеральной микробиоты и для сравнения слизистой оболочки кишечника и химуса у серебряного карася, обитающего в разных участках р. Днестр и в Кучурганском водохранилище, различающихся по гидрологическому и гидрохимическому режимам, а также по кормовым ресурсам.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Материал собран летом 2012 г. Объект исследования — серебряный карась Carassius carassius (L.). Рыбы отловлены в р. Днестр в районе г. Тирасполь (станция № 1: отобрано 5 экз., длина рыб 28.8 ± ± 1.8 см, масса 567 ± 44 г), в Кучурганском водохранилище озерного типа, расположенном между г. Тирасполь и устьем р. Днестр (станция № 2: отобрано 10 экз., длина рыб 232.4 ± 1.1 см, масса 652 ± ± 56 г) и в низовьях р. Днестр — пос. Маяки (станция № 3: отобрано 7 экз., длина рыб 32.2 ± 2.4 см, масса 698 ± 72 г), недалеко от впадения реки в Днестровский лиман. В качестве ферментативно активных препаратов использовали культуры микрофлоры, выделенной из химуса, а также химус и слизистую оболочку кишечника. Приготовление гомогенатов слизистой оболочки кишечника и химуса, а также условия сбора материала для микробиологического анализа содержимого кишечника подробно описаны ранее (Kuz'mina et al., 2011).
ПА (преимущественно активность трипсина, КФ 3.4.21.4) оценивали по увеличению концентрации тирозина по методу Ансона (Anson, 1938) в некоторой модификации. АА (суммарная активность а-амилазы, КФ 3.2.1.1, глюкоамилазы, КФ 3.2.1.3, и ферментов группы мальтаз, КФ 3.2.1.20) определяли при помощи метода Нельсона в модификации А.М. Уголева и Н.Н. Иезуитовой (1969). Для определения ПА в качестве субстрата использовали 1%-ный раствор казеина (рН 5.0—10.0, интервал 1.0), АА — 1%-ный раствор растворимого крахмала при тех же значениях рН. Инкубацию гомогената (рН 5.0—10.0, интервал 1.0) и субстрата осуществляли при температуре 20°С в течение 30 мин и непрерывном перемешивании в пяти повторностях. Об уровне ферментативной активности судили по приросту продуктов реакции за 1 мин инкубации субстрата и ферментативно активного препарата с учетом фона (количество тирозина или глюкозы в исходном гомогенате) в
расчете на 1 г сырой массы ткани (мкмоль/(г • мин)). Интенсивность окраски оценивали при помощи фотоколориметра КФК-2 (длина волны 670 нм). Результаты обработаны статистически при помощи стандартного пакета программ (Microsoft Office XP, приложение Excel) и приведены в виде средней и ошибки среднего. Достоверность различий оценивали при помощи критерия Стью-дента для малых выборок прир < 0.05.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Протеиназы. Данные по ПА слизистой оболочки свидетельствуют о том, что у рыб всех исследованных групп ее уровень в зоне нейтральных, а также слабокислых или слабощелочных значений рН, как правило, выше, чем у химуса (рис. 1). Так, активность протеиназ слизистой оболочки и химуса при рН 7.0 у карася с первой станции соответствует 5.37 ± 0.69 и 3.88 ± 0.22, второй - 8.00 ± 0.61 и 6.12 ± 0.41, третьей - 9.41 ± ± 0.87 и 5.14 ± 0.64 мкмоль/(г • мин). Поскольку энтеральная микробиота культивировалась в течение 48 ч, полученные данные по активности ферментов несопоставимы с таковыми слизистой и химуса. Вместе с тем одинаковые условия культивирования позволяют сопоставлять ПА энте-ральной микробиоты у рыб с разных мест обитания. Оказалось, что при рН 7.0 ПА энтеральной микробиоты у всех исследованных рыб ниже по сравнению с таковой слизистой и химуса (2.43 ± ± 0.21, 5.80 ± 0.24 и 3.37 ± 0.23 мкмоль/(г • мин)).
Сопоставление уровня ферментативной активности тех же препаратов в диапазоне рН от 5.0 до 10.0 показывает, что динамика активности протеиназ слизистой оболочки и химуса у всех исследованных рыб достаточно близка — минимум ПА в обоих случаях наблюдается при рН 5.0, максимум — при рН 10.0. У карасей с первой станции при рН 5.0 выявлено 36.7 и 33.1%, второй — 30.7 и 37.9% и третьей — 42.8 и 30.2 % максимальных значений при рН 10.0 соответственно. Относительная активность протеиназ кишечной микрофлоры карасей тех же групп при рН 5.0 составила 48.5, 18.1 и 62.9% максимальной активности. При этом особого внимания заслуживают различие формы кривых рН-функции и оптимумов рН протеиназ энтеральной микробиоты у рыб из разных мест обитания. Так, у карасей с первой станции оптимум рН отмечен при рН 7.0, второй — при рН 10.0, третьей — в зоне рН 6.0—8.0. У рыб с первой станции резко увеличивается ферментативная активность при рН 7.0, у рыб со второй станции наблюдаются два пика активности про-теиназ энтеральной микробиоты — при рН 7.0 и 10.0, а для рыб с третьей станции характерно отсутствие достоверных различий в уровне ферментативной активности в зоне рН 6.0—9.0.
Рис. 1. Влияние рН на ПА энтеральной микробиоты, химуса и слизистой оболочки кишечника карася из р. Днестр вблизи г. Тирасполь (а, б), Кучурганского водохранилища (в, г) и р. Днестр вблизи впадения в Днестровский лиман (д, е). 1 — энтеральная микробиота, 2 — химус, 3 — слизистая.
АА, мкмоль/г • мин
30 г (а)
AA, % от максимальной
(б)
-9-2
§--Ф--3
15
40 г
20
30
/
15^ / /
9 pH
9 pH
Рис. 2. Влияние рН на АА энтеральной микробиоты, химуса и слизистой оболочки кишечника карася из разных мест обитания (1—3 см. на рис. 1).
Гликозидазы. Полученные результаты свиде- правило, выше, чем у химуса. Так, при рН 7.0 у ка-
тельствуют о том, что уровень АА слизистой обо- рася с первой станции АА слизистой и химуса со-
лочки и химуса у рыб с разных станций в исследо- ответствуют 25.99 ± 0.67 и 23.96 ± 0.56, второй —
ванном диапазоне рН различен (рис. 2). При этом 34.37 ± 0.83 и 28.96 ± 0.36, третьей — 26.11 ± 0.45 и
активность гликозидаз слизистой оболочки, как 18.75 ± 0.48 мкмоль/(г • мин). У рыб с первой и тре-
0
тьей станций АА энтеральной микробиоты равны (7.48 ± 0.22 и 7.44 ± 0.15 мкмоль/(г • мин)), со второй — значительно выше (21.88 ± 1.15 мкмоль/(г • мин)).
Сопоставл
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.