ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2004, том 51, № 1, с. 73-79
УДК 581.1
ВЛИЯНИЕ ВИРУСА ТАБАЧНОЙ МОЗАИКИ НА СОДЕРЖАНИЕ ФОСФОЛИПИДОВ И АКТИВНОСТЬ ФОСФОЛИПАЗЫ Б В ЛИСТЬЯХ ТАБАКА
© 2004 г. И. М. Котельникова, Э. В. Некрасов, А. В. Крылов*
Амурский комплексный научно-исследовательский институт Амурского научного центра Дальневосточного отделения Российской академии наук, Благовещенск *Ботанический сад Амурского научного центра Дальневосточного отделения Российской академии наук,
Благовещенск Поступила в редакцию 11.12.2002 г.
Исследовали содержание фосфолипидов и активность фосфолипазы Б в листьях растений двух сортов табака (№сойапа гаЬасиж Ь.) с разной реакцией на инфицирование вирусом табачной мозаики (ВТМ). В зараженных листьях восприимчивого сорта Самсун содержание фосфолипидов и активность фосфолипазы Б не изменялись по сравнению с контролем в течение 7 суток после инокули-рования ВТМ. В листьях табака устойчивого сорта Ксанти некротический при развитии реакции сверхчувствительности общее содержание фосфолипидов не отличалось от контроля. Однако уровень фосфатидилглицерина в инфицированных листьях последовательно снижался, начиная с появления некротических участков и при дальнейшем их расширении. В это же время содержание фосфатидной кислоты и дифосфатидилглицерина увеличивалось. Уровень фосфатидной кислоты был также выше в участках листьев, удаленных от мест развития некрозов. Активность фосфолипазы Б имела тенденцию к повышению, как в местах развития некрозов, так и в удаленных от них участках листьев. Изменения в содержании фосфатидной кислоты имели сходный характер, поэтому повышение доли фосфатидной кислоты может быть результатом действия фосфолипазы Б. Это предполагает возможное участие фосфолипазы Б в развитии реакции сверхчувствительности и подтверждается более высоким уровнем активности фермента в листьях незараженных растений устойчивого сорта по сравнению с восприимчивым. Причины обнаруженных изменений содержания некоторых фосфолипидов и физиологическое значение фосфолипазы Б при сверхчувствительной реакции обсуждаются.
И1соПапа гаЬасиж - сорт Ксанти некротический - сорт Самсун - вирус табачной мозаики - фос-фолипиды - фосфолипаза й - реакция сверхчувствительности - восприимчивость
Вирусные инфекции вызывают различные изменения у растений-хозяев: морфологические, цитологические, физиологические и биохимические. Изменения метаболизма растений, сопровождающие развитие болезни, могут быть следствием внутриклеточного паразитизма вирусов, а также активации защитных механизмов растения, ограничивающих распространение патогена. Хотя размножение вируса и защитная реакция протекают одновременно, вклад каждого из этих процессов в изменение метаболизма зависит от восприимчивости растения к вирусу. Одной из форм устойчивости растений является реакция
Сокращения: ВТМ - вирус табачной мозаики, Ксанти нк. -Ксанти некротический, ФМ - фосфатидилметанол, ФС -фосфатидилсерин.
Адрес для корреспонденции: Котельникова Ирина Михайловна. 675000 Благовещенск, Релочный пер. 1. АмурКНИИ АНЦ ДВО РАН. Факс (4162) 42-59-31; электронная почта: kot@ascnet.ru
сверхчувствительности, когда на листьях в местах проникновения вируса формируются участки некротической ткани. Молодые листья вырастают здоровыми. Напротив, в листьях восприимчивых растений вирус свободно размножается и распространяется по всем органам. Такое системное инфицирование сопровождается развитием различных симптомов заболевания.
В этом отношении интерес представляют изменения при вирусной инфекции обмена липидов -компонентов мембран и участников сигнальных каскадов клеток растений. Цитологические исследования системно инфицированных растений показали, что вирусы влияют на ультраструктуру и количество клеточных органелл и мембранных структур [1, с. 33]. Изменения в ультраструктуре клеток обнаруживаются и при сверхчувствительной реакции растений [1, с. 53]. В ходе реакции сверхчувствительности изменяется состояние плазматических мембран, о чем свидетельствует усиление их проницаемости [2, 3].
Последнее время большое внимание уделяют сигнальной функции фосфолипидов в растениях [4, 5]. Наряду с такими признанными сигнальными системами, включающими превращения липи-дов, как липоксигеназная и фосфатидилинози-тольная, у растений выделяют фосфатидатную [6, с. 67], в которой ключевую роль играет фос-фолипаза Б (фосфатидилхолин-фосфатидилгид-ролаза, КФ 3.1.4.4). Кроме гидролазной активности с образованием ФК, фосфолипаза Б проявляет также трансферазную активность - в присутствии спиртов фермент переносит фосфатидиль-ную группу фосфолипида на спирт с образованием соответствующего фосфатидилпроизводного спирта [7].
Несмотря на важное значение мембран во взаимодействии вирусов и растительных клеток, а также обнаруженные изменения, которые претерпевают клетки в процессе развития заболеваний и в ходе приобретения устойчивости, к настоящему времени имеются только единичные работы о метаболизме липидов в растениях при вирусной инфекции [3, 8-11]. В этих работах основное внимание уделяли жирным кислотам, кроме того, анализ липидов инфицированных растений проводили после появления симптомов заражения. Возможные изменения состава липидов в период, предшествующий их появлению, остались неизученными. До сих пор не показано участие фосфолипидов и фосфолипазы Б в сигнальных каскадах, индуцированных вирусной инфекцией у растений.
Целью нашей работы было исследование состава фосфолипидов и активности фосфолипазы Б в листьях табака, инфицированного вирусом табачной мозаики (ВТМ), за период от начала заражения до появления симптомов заболевания. При этом сравнивали растения табака сорта Сам-сун, восприимчивого к ВТМ, и устойчивого сорта Ксанти некротический, проявляющего реакцию сверхчувствительности.
МЕТОДИКА
Растения табака (И1сойаиа tabacum Ь.) выращивали в вегетационном домике в теплое время года. Исследования проводили параллельно на двух сортах табака - устойчивого Ксанти некротический (Ксанти нк.) и восприимчивого Самсун. Заражали 5-6 растений каждого сорта и столько же растений использовали для контроля. Заражение проводили механической инокуляцией - натиранием листьев соком из листьев табака сорта Самсун, инфицированного обыкновенным штаммом ВТМ. Листья контрольных растений натирали водой. Обрабатывали по 6 листьев каждого растения, начиная с самого верхнего полностью развернувшегося листа. Для каждой точки отбора проб брали по одному листу с растения так,
чтобы в пробе присутствовали листья разных ярусов. Для получения навесок вырезали диски пробочным сверлом со всей поверхности анализируемых листьев без центральной жилки. Диски помещали в закрываемые бюксы и определяли вес навесок. Эксперимент выполнен в трех независимых опытах.
Для исследования фосфолипидов и фосфолипазы D в тканях, удаленных от мест развития некротических участков, одну половинку листа натирали соком из инфицированных листьев, а другую половинку натирали водой. В качестве контроля служили растения, чьи листья натирали только водой. В пробу отбирали по 6 листьев с каждого из 2 растений после появления некротических участков на 2-е сутки после заражения.
Анализ липидов. Перед экстракцией липидов навески листьев кипятили в воде 3 мин для инактивации липолитических ферментов. Липиды экстрагировали методом Bligh и Dyer [12]. Содержание общих липидов определяли гравиметрически после упаривания экстракта липидов досуха на ротационном испарителе в вакууме. Липиды разделяли на пластинках для ТСХ, приготовленных, как описано в работе [13]. Для определения суммарного содержания фосфолипиды отделяли от других липидных компонентов одномерной ТСХ в системе растворителей: гексан : диэтило-вый эфир : уксусная кислота (70 : 30 : 1, по объему) [14] и их количество определяли по фосфору как описано в работе [15]. Фосфолипиды разделяли методом двумерной ТСХ в системе растворителей: хлороформ : метанол : NH4OH : бензол (65 : 30 : 6 : 10, по объему) - 1-е направление и хлороформ : метанол : ацетон : уксусная кислота : вода : бензол (70 : 30 : 5 : 4 : 1 : 10, по объему) -2-е направление [16]. Классы фосфолипидов идентифицировали по расположению пятен на хроматограммах и с использованием специфических реагентов [14]. Количество фосфолипидов определяли по фосфору [15], измеряя поглощение растворов на спектрофотометре Specol 221 ("Carl Zeiss", Германия).
Определение активности фосфолипазы D. Активность фосфолипазы D определяли как транс-феразу по образованию фосфатидилметанола (ФМ) при инкубировании водного экстракта фермента в 50% (по объему) водном метаноле в присутствии ФХ модифицированным методом [17]. Для этого навеску растительной ткани растирали в ступке с песком, добавляли дистиллированную воду из расчета 1.5 мл воды на 1 г навески и продолжали растирать до гомогенного состояния. Гомогенат отжимали через капроновую ткань в центрифужную пробирку и центрифугировали 5 мин при 1000 об/мин на центрифуге MPW-310 (Польша). Для проведения реакции в микропробирки добавляли по 35 мкл дистиллированной во-
« 6 5г
о
6.0-
пс
§2 5.5 -
лм £ « 5.0-
1§.4.5-
8 - 4.0 | я 3.5 -!
аь
^2.5-
м 2 0'-1—1—1-1-1-1-1-1-^
С 0.10.51.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 Время после заражения, сут
Рис. 1. Изменение содержания суммы фосфолипидов в листьях табака сортов Самсун (1, 1') и Ксанти нк. (2, 2') после инфицирования ВТМ. Сплошные линии - контроль, пунктирные линии -инфицированные растения. Представлены средние трех независимых опытов и стандартные ошибки средних.
ды, 25 мкл полученного после центрифугирования экстракта, 20 мкл метанола, 40 мкл раствора ФХ в метаноле с концентрацией 10 мг/мл. Смесь встряхивали на шейкере, инкубировали 15 мин при комнатной температуре. Для экстракции субстрата (ФХ) и продукта (ФМ) добавляли 340 мкл метанола, 400 мкл хлороформа и 740 мкл 0.1% водного раствора №С1. Смесь встряхивали на шейкере и оставляли расслаиваться в холодильнике. После расслаивания верхний водно-метанольный слой отбрасывали. На пластинки для ТСХ наносили по 10 мкл хлороформного экстракта. ФМ отделяли от ФХ методом одномерной ТСХ в системе раст
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.