ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2007, том 54, № 3, с. 373-380
УДК 581.1
ВЛИЯНИЕ ВОДНОГО ДЕФИЦИТА НА ДЫХАНИЕ ПРОВОДЯЩИХ ПУЧКОВ ЛИСТОВОГО ЧЕРЕШКА САХАРНОЙ СВЕКЛЫ
© 2007 г. Н. А. Шугаева, Э. И. Выскребенцева, С. О. Орехова, А. Г. Шугаев
Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева Российской академии наук, Москва
Поступила в редакцию 15.06.2006 г.
Изучали влияние долговременной засухи на скорость поглощения кислорода и активность митохон-дриальных оксидаз: цитохромоксидазы и альтернативной CN-резистентной оксидазы (АО), чувствительной к салицилгидроксамовой кислоте (СГК), в сосудисто-волокнистых пучках, изолированных из черешков донорных листьев сахарной свеклы (Beta vulgaris L.) и борщевика (Heracleum sos-novskyi L.). В условиях нормальной влажности почвы (70% от полной влагоемкости, ПВП) поглощение кислорода проводящими пучками сахарной свеклы характеризовалось высокой интенсивностью (более 700 мкл О^г сырой массы ч)) и выраженной цитохромоксидазной природой терминального окисления (до 80% ингибирования дыхания в присутствии 0.5 мМ KCN). Долговременный водный дефицит (40% ПВП) не оказывал существенного влияния на скорость дыхания пучков, но сопровождался увеличением степени его CN-резистентности. На раннем этапе засухи (10 суток) снижение активности цитохромного пути окисления компенсировалось в основном активацией АО митохондрий, тогда как более длительное обезвоживание растений сопровождалось активацией дополнительных окислительных систем, нечувствительных к действию KCN и СГК. Аналогичные, но более яркие изменения активности терминальных оксидаз были обнаружены в проводящих пучках листьев дикорастущего борщевика в условиях длительной естественной засухи. Высказывается предположение, что торможение цитохромного, сопряженного с синтезом АТФ, пути окисления в клетках донорных листьев растений сахарной свеклы должно оказывать негативное влияние на скорость передвижения и накопления ассимилятов в корнеплоде и может являться важной причиной резкого снижения урожайности этой сельскохозяйственной культуры в условиях недостатка влаги.
Beta vulgaris - листовые черешки - проводящие пучки - дыхание - ингибиторы - терминальные оксидазы - водный дефицит
ВВЕДЕНИЕ
Влияние водного дефицита на растения представляет традиционный интерес, поскольку из практики растениеводства известно, что в условиях длительной или повторяющейся засухи общая продуктивность растений, в частности, сахарной свеклы, резко снижается [1, с. 80; 2]. Накопленные на протяжении многих десятилетий данные
Сокращения: АО - альтернативная оксидаза митохондрий; АФК - активные формы кислорода; ДЭДТК - диэтилдитио-карбамат; ПВП - полная влагоемкость почвы; СГК - сали-цилгидроксамовая кислота; ЦРД - цианид-резистентное дыхание; ЭТЦ - электрон-транспортная цепь; Кальт - максимальная активность АО; ^льт - реальный вклад АО в дыхание; УцШ - активность цитохромного пути окисления; Уост - скорость остаточного дыхания.
Адрес для корреспонденции: Шугаев Александр Григорьевич. 126276 М осква, Ботаническая ул., 35. Институт физиологии растений РАН. Факс: 007 (495) 977-80-18; электронная почта: ag_shugaev@ippras.ru
указывают, что это может быть связано с нарушением целого ряда функций растений, включая рост, дыхание, фотосинтез и транспорт ассимилятов.
Давно известно, что изменение содержания воды в растениях оказывает сильное влияние на дыхание. В частности, показано, что в условиях длительного водного дефицита происходит резкое снижение энергетической эффективности дыхания листьев, корней и других органов растений [3; 4, с. 196]. Причины и молекулярные механизмы этого явления стали понятными только в настоящее время, когда была установлена важная роль процессов свободного окисления и разобщения в митохондриях животных и растений в предотвращении окислительного стресса [5, 6]. В соответствии с современными представлениями, действие на растения различных неблагоприятных факторов, включая засуху, нарушает перенос электронов по основному (цитохромному) пути окисления, который сопряжен с синтезом АТФ
и терминальной оксидазой которого является чувствительная к цианиду цитохромоксидаза. В результате происходит резкое ускорение генерации митохондриями супероксида и других активных форм кислорода (АФК), развивается окислительный стресс, активирующий защитные механизмы, среди которых важную роль, по-видимому, играет альтернативная CN-резистентная, чувствительная к салицилгидроксамовой кислоте (СГК), оксидаза митохондрий [6-9]. Функционирование альтернативной оксидазы (АО) митохондрий не связано с транспортом протонов, а при окислении субстратов с ее участием шунтируются два (второй и третий) из трех пунктов энергетического сопряжения в электрон-транспортной цепи (ЭТЦ и, таким образом, резко снижается энергетическая эффективность дыхания. В то же время, активация при абиотическом стрессе этого пути свободного окисления, по-видимому, предотвращает избыточную генерацию АФК митохондриями растений, снижая степень восстановленности переносчиков электронов дыхательной цепи, в первую очередь, пула убихинона [5-8].
Данные о влиянии засухи на дальний транспорт ассимилятов достаточно противоречивы, тем не менее, большинство авторов полагают, что длительное нарушение водного режима замедляет этот процесс [10, с. 470; 11]. Причины этого точно не установлены, а предположения весьма разнообразны - от торможения фотосинтеза до понижения скорости роста растений в условиях водного дефицита [10, с. 473]. По нашему мнению, важную роль может играть и прямое воздействие водного дефицита на функционирование митохондрий в клетках лептома проводящих пучков, активируя в них процессы разобщения и/или свободного окисления, ведущие к снижению энергетической эффективности дыхания проводящих тканей.
Исходя из этого, целью данной работы было изучение влияния долговременной засухи на дыхание и активность митохондриальных оксидаз изолированных проводящих пучков донорных листьев растений.
МЕТОДИКА
Основным объектом исследований в данной работе были растения сахарной свеклы (Beta vulgaris L.) сорта Верхнячская 031, которые выращивали в сосудах в условиях оранжереи. Сосуды содержали 5 кг абсолютно сухой почвы. Растения поливали водой по весу, оптимальные условия полива (контроль) составляли 70% от полной влаго-емкости почвы (ПВП). На 30-е сутки после появления всходов для части растений создавали условия засухи путем снижения влажности почвы до 40% ПВП. В экспериментах использовали как контрольные, так и опытные растения, выдер-
жанные в условиях недостаточного увлажнения почвы в течение 30 суток. Используемый режим полива на протяжении экспериментального периода не приводил к заметному изменению внешнего вида опытных растений по сравнению с контрольными. Серия опытов была проведена с дикорастущими растениями борщевика (Негас1еит sosnovskyi L.), произрастающими в течение месяца в условиях естественной засухи.
Поглощение кислорода тканью определяли полярографически, используя электрод конструкции Шольца и Островского [12]. Обсушенные фильтровальной бумагой сосудисто-волокнистые пучки, выделенные из донорных листьев растений, с суммарной массой 20-30 мг помещали в термостатируемую (25°С) ячейку, содержавшую дистиллированную воду (1.5 мл) при постоянном перемешивании. Между пучками и магнитиком помещали тефлоновую сеточку. После 3-5 мин определения скорости дыхания в ячейку вносили ингибиторы.
Оптимальные концентрации ингибиторов, достаточные для полного подавления активности соответствующих ферментов, были выявлены в предварительных опытах путем титрования. Были использованы следующие концентрации ингибиторов: KCN - 0.5 мМ, СГК - 5 мМ, антимицина А - 40 мкМ, диэтилдитиокарбамата (ДЭДТК) -1 мМ. Ингибирующее влияние KCN на поглощение кислорода проводящими пучками проявлялось через 2-3 мин, для выявления максимального эффекта других ядов требовалось больше времени. В предварительных экспериментах было также показано, что в отсутствие ингибиторов скорость дыхания тканей оставалась постоянной не менее 3 ч.
Активность цитохромного пути митохондри-ального окисления (Кцит) определяли по степени чувствительности дыхания к цианиду. Максимальную активность (мощность) альтернативного пути митохондриального окисления (^альт) определяли по степени чувствительности дыхания к СГК в присутствии Кс^ а остаточного дыхания (Кост) - по скорости поглощения кислорода тканью в присутствии ингибиторов основного и альтернативного пути митохондриального окисления [13].
В таблице приведены средние арифметические не менее, чем из 15 биологических повторно-стей и их стандартные отклонения. На рис. 1 приведены данные характерного опыта, имеющего 5-кратную биологическую повторность. Каждая точка на рис. 2-4 представлена усредненными данными 3-10 определений с их стандартными отклонениями. На рис. 5 представлены усредненные данные из 3-5 определений.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Характеристика дыхания проводящих пучков листьев сахарной свеклы в условиях нормального увлажнения почвы
Известно, что характерной особенностью дыхания сосудисто-волокнистых пучков листовых черешков растений, включая сахарную свеклу и борщевик, является его высокая интенсивность и чувствительность к цианиду [10, с. 446; 14; 15]. В наших опытах было обнаружено (таблица), что интенсивность дыхания проводящих пучков донорных листьев контрольных растений сахарной свеклы, выращиваемых в условиях нормальной увлажненности почвы (70% ПВП), на протяжении исследуемого периода роста растений оставалась высокой и в среднем составляла 850 мкл 02/(г сырой массы ч).
На протяжении экспериментального периода развития контрольных растений сахарной свеклы изолированные проводящие пучки обладали высокой и практически неизменной чувствительностью к цианиду (таблица). Предварительное исследование, проведенное нами на полевых растениях сахарной свеклы показало (рис. 1), что максимальная степень подавления дыхания цианидом достигалась уже при 0.3 мМ КС№ Использование низких концентраций KCN (0.3-0.5 мМ) практически исключало возможное влияние ингибитора на пероксидазу и полифенолоксидазу (облада
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.