БИОХИМИЯ, 2014, том 79, вып. 5, с. 595 - 604
УДК 577.1
ВЛИЯНИЕ ЗАМЕН КОНСЕРВАТИВНЫХ АМИНОКИСЛОТНЫХ ОСТАТКОВ НА СТРУКТУРУ И СТАБИЛЬНОСТЬ БЕЛКА Hfq*
© 2014 В.Н. Мурина1**, Б.С. Мельник1, В.В. Филимонов1, М. Улайн2, М.С. Вейсс2, У. Мюллер2, А.Д. Никулин1
1 Институт белка РАН, 142290 Пущино Московской обл., ул. Институтская, 4; факс: +7(495)514-0218, электронная почта: thyrada@rambler.ru
2 Institute for Soft Matter and Functional Materials, Helmholtz-Zentrum Berlin fur Materialien und Energie, Albert-Einstein-Strasse 15, Berlin 12489, Germany
Поступила в редакцию 21.01.14
Белок Hfq является термостабильным РНК-связывающим бактериальным белком, формирующим характерную четвертичную структуру в виде гомогексамеров. На основе гомологии первичных и пространственных структур белок Hfq относят к семейству Sm-подобных (Sm-like или LSm) белков. Однако, несмотря на высокую степень гомологии с бактериальным LSm белком Hfq, архейные и эукариотические LSm белки формируют гептамеры; имеются примеры пентамера и октамера. В данной работе мы исследовали влияние консервативных межсубъединичных водородных связей на пространственную организацию белка Hfq. Были определены структуры и стабильность мутантных форм белка Hfq с единичными заменами Gln8Ala, Asn28Ala, Asp40Ala и Tyr55Ala. Все полученные белки имели одинаковую гексамерную организацию, но различную стабильность. Удаление одной межсубъединичной водородной связи в случае замен Gln8Ala, Asp40Ala и Tyr55AIa приводило к понижению стабильности гексамера Hfq. Белок Tyr55Ala Hfq, так же как и ранее исследованный His57Ala Hfq, обладал пониженной термостабильностью, по всей видимости, из-за увеличения доступности гидрофобного ядра для молекул растворителя.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: Hfq, пространственная структура, четвертичная структура, термостабильность белков.
Шд является основным посредником при регуляции экспрессии генов малыми регулятор-ными РНК (вКМА) в бактериях (последние обзоры — [1—4]), структурно принадлежит к семейству 8ш/8ш-подобных белков (Ь8ш) с характерной четвертичной структурой в виде кольца [5]. Каждый мономер Ь8ш белков состоит из пятитяжевого р-барреля, с ^-конца которого расположена а-спираль, а с С-конца — длинный неупорядоченный хвост. Центральная часть Ь8ш белков содержит два консервативных аминокислотных мотива, называемых 8ш1 (тяжи р1, р2 и Р3) и 8ш2 (тяжи р4 и р5) [6, 7]. 8ш1 мотив имеет выраженную гомологию среди всех бактериальных, архейных и эукариотических белков [8—11], в то время как последователь-
* Первоначально английский вариант рукописи был опубликован на сайте «Biochemistry» (Moscow), Papers in Press, BM 14-018, 16.03.2014.
** Адресат для корреспонденции.
ность 8ш2 мотива в бактериальных белках Шд отличается от консенсуса в архейных и эукарио-тических Ь8ш белках [7]. Несмотря на эти вариации первичных структур, третичная структура Ь8ш белков одинакова. Организация белков в кольцевую четвертичную структуру во всех случаях определяется контактами между р4- и Р5-тяжами соседних мономеров, в результате чего образуется «сквозной» для всего олигомера Р-лист с общим гидрофобным ядром. Известно, что бактериальные белки Шд формируют исключительно гомогексамеры [12], в то время как архейные Ь8ш и эукариотические 8ш белки существуют как гомо- и гетерогептамеры соответственно [5]. Кроме того, обнаружено, что 8ш-подобный белок цианофага обладает симметрией С5 [13], а Ь8ш3 белок из БассНаготусез сеге-\isiae — симметрией С8 [14]. Причина такой разницы в упаковке структурно схожих Ь8ш белков до сих пор неизвестна, и все предложенные гипотезы не подтвердились [7, 14].
Было предположено, что межсубъединич-ные водородные связи между атомами боковых цепей консервативных аминокислотных остатков играют важную роль в стабилизации четвертичной структуры белка Hfq [15]. В Hfq пять консервативных аминокислотных остатков (Gln8, Asn28, Asp40, Tyr55 и His57) формируют межмолекулярные водородные связи (рис. 1). Два из них, His57 и Tyr55, входят в высококонсервативный консенсус YKHI мотива Sm2 бактериальных Hfq. Ранее было показано, что замены His57 заметно уменьшают стабильность белка, но не влияют на пространственную структуру белка Hfq [16]. В представленной работе исследуется влияние замен Gln8Ala, Asn28Ala, Asp40Ala и Tyr55Ala на структуру и стабильность белка Hfq из Pseudomonas aeruginosa (PaeHfq).
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Сайт-направленный мутагенез, экспрессия генов и очистка рекомбинантных белков. Для получения мутантных форм белка был использован
а
QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit («Stra-tagene», США). ПЦР проводили с использованием плазмиды pET22b(+)/Hfq и олигонуклео-тидных праймеров, содержащих необходимые замены.
Полученные конструкции проверяли секве-нированием. Экспрессию генов и очистку полученных мутантных белков (за исключением белка Tyr55Ala PaeHfq) проводили, как описано ранее [15]. Замена Tyr55Ala заметно снизила термостабильность белка, поэтому прогрев лизата клеток при выделении этого белка не проводили. Ранее описанную схему очистки белка Tyr55Ala PaeHfq модифицировали следующим образом: клеточный лизат в буфере, содержавшем 0,5 М сульфата аммония, 0,5 М NaCl и 50 мМ Tris-HCl (pH 8,0) загружали на колонку с бутил-сефарозой и смывали раствором 50 мМ NaCl, 50 мМ Tris-HCl (pH 8,0). Окончательную стадию очистки проводили на анионообменной колонке с DEAE-сефарозой в градиенте NaCl от 50 мМ до 1 М в 50 мМ Tris-HCl-буфере (pH 8,0). Гомогенность полученных белков была проверена электрофорезом в 15%-ном ПААГ в денату-
б
5
Рис. 1. а — Ленточное представление гексамера белка Шс[. Мономеры белка показаны разными оттенками серого. б — Аминокислотные остатки, образующие водородные связи между соседними мономерами белка. Рисунок сделан в программе РуМо1
рирующих условиях в присутствии SDS и в не-денатурирующих условиях при pH 4,5.
Измерение спектров кругового дихроизма (КД). Измерения проводили на спектрополяри-метре J600 CD Spectrometer («JASCO», Япония) с контролируемым термостатом Julabo F25. Измерения проводили при длине волны 220 нм в кварцевой кювете с длиной оптического пути 0,1 мм. Регистрацию изменений эллиптичности белка при 220 нм проводили в растворе 0,3 М NaCl, 50 мМ Tris-HCl (pH 8,0), содержавшем 1 M гуанидин гидрохлорида (GuHCl).
Диффренциальная сканирующая микрокалориметрия (ДСК). Эксперименты по плавлению белка проводили на микрокалориметре SCAL-1 с ячейкой объемом 0,32 мл при скорости нагрева 1 K/мин в температурном диапазоне 10—120°. Верхний температурный предел был достигнут за счет повышения давления в ячейке до 2,5 атм [17]. Образцы предварительно уравновешивали диализом против глицинового буфера (25 мМ, рН 2,0 или 3,0) или ацетатного буфера (25 мМ, pH 4,0). Концентрация белка в экспериментах варьировала (1—2 мг/мл). Парциальные объемы и тепловые эффекты были приведены к молярной концентрации мономеров белка из расчета значения характерного парциального объема 0,73 мл/мг [18].
Кристаллизация белков. Анализ температурного сдвига флуоресценции белков. Поиск условий кристаллизации белков проводили как в «висячих», так и в «сидячих» каплях при 22°. Для поиска и оптимизации условий кристаллизации использовали метод температурного сдвига флуоресценции белка (thermal shift assay) на приборе iCycler iQ Real Time PCR («Bio-Rad», США) [19, 20]. Для проверки полученных кристаллов белков использовали возможности in situ скрининга кристаллизационных плашек на линии BL14.1 синхротрона BESSY («Берлин», Германия) [21]. Детальные условия кристаллизации белков приведены в табл. 1.
Электрофорез в полуденатурирующих условиях. Эксперименты проводили в 15%-ном ПААГ с содержанием 0,1% SDS по процедуре, описанной ранее для белка Hfq из E. coli [22]. Аликвоты белков по 20 мкг в присутствии 0,1% SDS были помещены на 15%-ный ПААГ без стадии прогрева. SDS был добавлен к образцам белков непосредственно перед нанесением образцов на гель.
Определение и уточнение структуры белков.
Эксперименты по дифракции рентгеновских лучей с кристаллов белков проводили на системе X8 Proteum («Bruker-AXS», Нидерланды) в Институте белка РАН или на линии BL14.1 синхро-
Таблица 1. Условия кристаллизации
Модификация белка Условия кристаллизации Пространственная группа и параметры ячейки Максимальный размер кристаллов, мкм Предел разрешения, Ä Содержание асимметричной части ячейки кристалла
Дикий тип 12% (w/v) PEG4000; 200 мМ NH4Cl; 5 мМ CdCl2; 50 мМ Tris-HCl; pH 8,5 P2J2A; a = 61,0; b = 73,3; c = 106,2; a = ß = y = 90° 300 1,6 гексамер
Q8A 7% (w/v) ММEPEG2000; 2% MPD; 20 мМ ZnCl2; 50 мМ Tris-HCl; pH 6,5 P2j; a = 66,59; b = 116,54; c = 66,62; a = y = 90°; ß = 119,98° 200 2,16 два гексамера
N28A 5% (w/v) ММEPEG2000; 0.2% глицерина; 3% MPD; 30 мМ ZnCl2; 50 мМ Tris-HCl; pH 6,5 P3j2j; a = b = 66,8; c = 189,7; a = ß = 90°; y = 120° 100 3,4 гексамер
D40A 2.4 M (NH4)2SO4; 0,1 M HEPES; pH 7,0 P6; a = b = 65,79; c = 28,13; a = ß = 90°; y = 120° 50 1,8 мономер
Y55A 25% ММEPEG 2000; 0,2 M MgCl2; 10 мМ CuSO4; 50 мМ Tris-HCl; pH 6,5 P21; a = 63,8; b = 121,2; c = 65,0; a = y = 90°; ß = 108,2° 70 2,8 два гексамера
трона BESSY HZB («Берлин», Германия) [21]. Данные обрабатывали, соответственно, с помощью программ Proteum (Bruker-AXS) или XDS [23] и приводили к общей шкале в программах XPREP («Bruker-AXS», Нидерланды) или SCALA (CCP4 [24]). Анализ дифракционных данных показал наличие двойникования во всех наборах. Структуры белков определяли методом молекулярного замещения с использованием программы PHASER [25]. Первоначальной моделью служил белок дикого типа PaeHfq (PDB 1U1S [15]). В большинстве случаев для молекулярного замещения использовался гексамер за исключением белка Asp40Ala PaeHfq, где исходной моделью послужил мономер белка. Уточнение структур белков проводили с использованием программного комплекса PHENIX [26]. На первой стадии проводили уточнение модели как твердого тела, в последующем применяли протокол отжига модели и стандартного уточнения в комбинации с ручной правкой модели в программе Coot [27, 28]. Молекулы воды были добавлены к моделям, используя функцию «water p
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.