МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 2011, том 45, № 2, с. 386-390
КРАТКИЕ СООБЩЕНИЯ
УДК 577.218
ВНЕКЛЕТОЧННЫЙ РЕКОМБИНАНТНЫЙ ЧЕЛОВЕЧЕСКИЙ БЕЛОК ТЕПЛОВОГО ШОКА БТШ70 ВЛИЯЕТ НА ИЗМЕНЕНИЕ СПЕКТРА БЕЛКОВ ПРИ АКТИВАЦИИ МАКРОФАГОВ, ИНДУЦИРОВАННОЙ ЭНДОТОКСИНОМ
© 2011 г. Е. А. Рожкова1, О. Г. Зацепина1, М. М. Юринская2, М. Г. Винокуров2, М. Б. Евгеньев1*
Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук, Москва, 119991 2Институт биофизики клетки Российской академии наук, Пущино, Московская обл., 142290
Поступила в редакцию 07.09.2010 г. Принята к печати 13.10.2010 г.
Ключевые слова: внеклеточный рекомбинантный белок теплового шока 70 кДа, липополисахариды, макрофаги, двумерный электрофорез.
THE EFFECT OF EXTRACELLULAR RECOMBINANT HUMAN HEAT SHOCK PROTEIN 70 (HSP70) ON PROTEIN PATTERN OBSERVED AFTER ENDOTOXIN-INDUCED MACROPHAGE ACTIVATION, by E. A. Rozhkova1, O. G. Zatsepina1, M. M. Yurinskaya2, M. G. Vinokurov2, M. B. Ev-gen'ev1* (1Engelhardt Institute of Molecular Biology, Russian Academy of Sciences, Moscow, 119991 Russia; *e-mail: misha572001@yahoo.com; 2Institute of Cell Biophysics, Russian Academy of Sciences, Pushchino, Moscow Region, 142290 Russia). The protein pattern of mouse macrophage strain (J774) has been investigated using 2D electrophoresis after combined action of bacterial endotoxins (LPS), heat shock treatment (HS) and administration of recombinant human Hsp70. The investigation demonstrated significant protective effect of HS and recombinant Hsp70 treatment applied before LPS introduction. This effect is apparently realized by means of several signal transduction systems. In the course of the investigation, we have identified eight proteins, which exhibited pronounced changes in their synthesis due to combined treatment. The data accumulated may shed light on molecular mechanisms underlying protective antiseptic action of HS and/or recombinant Hsp70 applied before LPS administration.
Keywords: extracellular heat shock protein 70, bacterial lipopolysaccharide, macrophages, 2D electrophoresis.
В настоящее время сепсис считается одной из наиболее сложных и недостаточно изученных проблем медицины. Несмотря на значительные успехи в выяснении механизмов его развития, сепсис остается главной причиной смерти в палатах интенсивной терапии [1]. При этом в 45—60% случаев сепсис вызывается грамотрицательными бактериями и в 65—70% случаев становится причиной септического шока [2]. Основную роль в инициировании ответа организма на вторжение грамотрицательных бактерий играют липополисахариды (ЛПС) бактериальной стенки (эндотоксины) [3, 4]. При массивном попадании бактерий в организм возможно развитие чрезмерного ответа, при котором возникают различные нарушения как на клеточном, так и на физиологическом уровне. В результате может развиться эндотоксический шок [5], зачастую приводящий к летальному исходу.
У многих организмов, включая млекопитающих, важными стрессовыми белками являются белки теплового шока, в частности БТШ70 [6]. За послед-
* Эл. почта: misha572001@yahoo.com
ние годы опубликованы новые данные о том, что БТШ70 может находиться во внеклеточном пространстве, функционируя как специализированные сигнальные молекулы — цитокины [7]. Появление внеклеточного БТШ70 вызывает активацию различных звеньев иммунной системы, воспринима-ясь ею как сигнал "опасности" [8]. Это приводит к усилению продукции цитокинов, повышению скорости фагоцитоза и активации системы комплемента, что увеличивает потенциал БТШ70 как противовоспалительного фактора. Следует отметить, что данные эффекты вызывает как белок, высвобождаемый из клеток во внеклеточное пространство, так и экзогенный БТШ70 [9]. Это может быть важным для терапевтического применения БТШ70.
Ранее мы наблюдали защитный эффект предварительного введения различных препаратов БТШ70 (рекомбинантного человеческого и выделенного из сердечной мышцы верблюда) как на уровне целого организма, так и на уровне клеток (нейтрофилов человека и макрофагов мыши) [10]. Чтобы посмотреть, что происходит в клетках на молекулярном уровне, было интересно сравнить об-
ВНЕКЛЕТОЧННЫЙ РЕКОМБИНАНТНЫЙ ЧЕЛОВЕЧЕСКИЙ БЕЛОК
387
Двумерный электрофорез клеток J774, меченных 3^-метионином. а - Контрольные клетки, культивированные при 37°С. б - Клетки, обработанные БТШ70, перед воздействием ЛПС при 37°С. 1 — Gгp94; 2 — Тгар1; 3 — Dpysl2; 4 — Sqstm1; 5 - И^ОТ К; 6 - Hspd1; 7 - Епо1; 8 - Апха5.
щие картины синтеза белков в макрофагах J774 мыши при комбинированном воздействии теплового шока, рекомбинантного БТШ70 человека, наработанного в системе экспрессии в клетках Spodoptera frugiperda, и ЛПС.
Цель настоящей работы — изучение молекулярных механизмов защитного действия экзогенного рекомбинантного БТШ70 человека в модели эндо-токсемии, вызванной введением ЛПС (Escherichia coli), на культуре макрофагов J744 мыши.
Макрофаги мыши (линия J774), полученные из Российской коллекции клеточных культур Института цитологии РАН, культивировали в среде Игла в модификации Дульбекко ("Sigma") с добавлением термоинактивированной 10%-ной эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота ("HyClone", Logan UT), проверенной на присутствие эндотоксина (0.01 ед/мл), 1% пенициллина, 1% стрептомицина, 2 мМ L-глутамина при 37°С в среде, содержащей 5% CO2. В день опыта клетки собирали центрифугированием, определяли их количество и доводили их концентрацию свежей культуральной средой до 2 х 106 клеток/мл среды. На каждую пробу брали от 5 до 6 млн. клеток во флаконах объемом 10 мл. Тепловой шок проводили на водяной бане при +43°С в течение 30 мин. После теплового шока в пробы добавляли БТШ70 и/или ЛПС из E. coli O55:B5 или O111:B4 ("Sigma") в концентрации 1 мкг/мл. В опытах по защитному действию БТШ70 ЛПС добавляли спустя 10 мин после введения БТШ70 (при комнатной температуре). Затем все пробы культивировали при +37°С в течение 3 ч и снова определяли концентрацию клеток и их жизнеспособность. Каждая проба содержала 1.5 х 106 клеток, которые метили 1.85 МВк 3^-метионина ("Am-ersham Biosci. Corp.") в 200 мкл раствора Хенкса в течение 1 ч при +37°С. После этого клетки отмывали в растворе Хенкса, осадок растворяли в 75 мкл
буфера О'Фаррелла, замораживали в жидком азоте и хранили при —70°С. Ген рекомбинантного БТШ70 человека для дальнейшей экспрессии клонировали под полиэдриновым промотором в бак-миду, как описано в [11]. Рекомбинантный белок, синтезированный в клетках Spodoptera frugiperda, очищали на смоле Ni-NTA согласно рекомендациям производителя ("QIAGEN"). Двумерный гель-электрофорез проводили согласно классическому методу О'Фаррелла [12] с некоторыми вариациями. На трубку брали 1.2 х 106 клеток и проводили изо-электрофокусирование при 300 В в течение 16 ч. Электрофорез во втором направлении проводили в 12%-ном полиакриламидном геле. Гели окрашивали кумасси R-250, высушивали и экспонировали на рентгеновскую пленку в течение 5 дней. Пятна, соответствующие белкам, синтез которых изменился, оценивали по включению 358-метионина, вырезали из препаративного геля и гидролизовали трипсином. Образцы анализировали на масс-спектрометре MALDI TOF-TOF Ultraflex II ("Bruker"). Белки идентифицировали по "пептидному фингерпринту" при помощи программы Mascot [13] и базы данных NCBI. Уровень включения 358-метионина определяли с помощью сцинтилляционного счетчика в жидком сцинтилляторе ("МР Biomedicals Ecolume"). С этой целью белковое пятно вырезали из геля и выдерживали в 60 мкл 30%-ной перекиси водорода в течение ночи при 65°С. Полученный раствор смешивали с 5 мл жидкого сцинтиллятора и измеряли радиоактивность в сцинтилляционном счетчике (по 1 мин на пробу).
В результате проведенной работы мы обнаружили восемь внутриклеточных белков (рисунок), уровень синтеза которых значительно варьировал при действии на макрофаги J774 бактериального эндотоксина в комбинации с прекондиционированием БТШ70 и обработкой тепловым шоком по сравне-
388
РОЖКОВА и др.
Обнаруженные белки и уровень их синтеза
Белок и его номер в NCBI
Роль в клетке
Наблюдаемое изменение уровня синтеза белка
Grp94, или Нр90Ь1, gp96 № 035761.1
Тгар1 (TNF гесерШ^а^аа^ ed рго1е1п 1) №_080784.1
Dpysl2 (Dihydropyrimidiпase-Ике 2 рго!ет), или Сгтр2 №_034085.2
Sqstm1 (Sequestosome 1), или р62 № 035148.1
hпRNP К (Heterogeпeous пис1еаг riboпucleoproteiп К) NP 079555.1
Hspd1
NP 034607.3
Eпo1 (eпolase 1) № 075608.2
Апха5 (Аппех1п А5) NP 033803.1
Относится к семейству БТШ90 в эндоплазмати-ческом ретикулуме. При клеточном стрессе повышается его уровень, что приводит к воспалительному ответу. Не синтезируется при тепловом шоке.
Митохондриальный БТШ75. Антиапоптотиче-ская роль при разных видах стресса. Защищает клетки от окислительного стресса.
Участвует в реорганизации цитоскелета, регулируя миграцию клеток. Его синтез зависит от активности клетки.
Убиквитин-связывающий белок, который удаляет полиубиквитинированные белки из клетки. Предупреждает чрезмерный воспалительный ответ. Индуцируется в ответ на окислительный стресс.
Вовлечен во множество процессов, составляющих экспрессию генов. Служит "стыковочной платформой" для взаимодействия и объединения многих сигнальных каскадов. Фосфорили-руется в ответ на внеклеточные сигналы (например, при окислительном стрессе).
Митохондриальный БТШ60. Участвует во многих видах стресса. Эндогенный БТШ60 защищает от клеточной смерти, поддерживая митохон-дриальное окислительное фосфорилирование. Проапоптотическая роль.
Мультифункциональный белок, участвующий в гликолизе и глюконеогенезе. Регуляторная роль при многих стрессовых состояниях. Играет важную роль в организации активного цитоскелета, обеспечивая подвижность клеток в ответ на ЛПС-стимулы.
Связывается с фосфатидилсерином и эффективно влияет на поглощение апоптотических и некротических клеток макрофагами. Противовоспалительный эффект.
Значительно возрастает при обработке с ЛПС. Снижение при тепловом шоке. При введении БТШ70 до обработки ЛПС уровень падает ниже контрольного.
Усиление при всех воздействиях, наиболее значительное под действием ЛПС. Снижение
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.