РОССИЙСКИЙ ИММУНОЛОГИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2015, том 9(18), № 1, с. 107-110
КРАТКОЕ СООБЩЕНИЕ
ВНЕКЛЕТОЧНЫЕ БЕЛКИ ТЕПЛОВОГО ШОКА 70 кДа ОКАЗЫВАЮТ ИНГИБИРУЮЩИЙ ЭФФЕКТ НА ПРОДУКЦИЮ АКТИВНЫХ ФОРМ КИСЛОРОДА ФАГОЦИТАМИ
© 2015 г. Н.И. Троянова, М.А. Шевченко, А.А. Бойко, Р.Р. Мирзоев, М.А. Перцева, Е.И. Коваленко, А.М. Сапожников
Институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук, Москва, Россия
Поступила: 12.10.2014. Принята: 15.01.2015
Активные формы кислорода (АФК), продуцируемые фагоцитирующими клетками иммунной системы, играют важную роль в первой линии защиты организма от патогенных микроорганизмов. Основным источником АФК у всех разновидностей фагоцитирующих клеток является мембрано-ассоциированный мультимолекулярный комплекс ЫЛОРН-оксидазы. Процесс формирования этого мембрано-ассоциированного ферментного комплекса и его активность зависят от многих факторов, способных как усиливать, так и подавлять интенсивность генерации АФК. Наши предыдущие данные и результаты работ других авторов указывают на то, что одно из звеньев системы ограничения уровня продукции фагоцитами АФК может быть связано с иммуномодулирующей активностью внеклеточного пула БТШ70. В настоящей работе мы использовали ряд клеточных моделей с применением ингибиторов ЫЛОРН-оксидазы для анализа возможной связи механизмов супрессирующего действия БТШ70 на продукцию АФК фагоцитами с взаимодействием этого протеина с субъединицами данного ферментного комплекса. Полученные результаты подтвердили литературные сведения о способности экзогенных БТШ70 модулировать активность ЫЛЭРН-оксидазы и впервые продемонстрировали ингибирующее действие этих протеинов на интенсивность генерации АФК во внутриклеточном пространстве фагоцитов.
Ключевые слова: нейтрофилы, активные формы кислорода, ЫЛЭРН-оксидаза, белки теплового шока
ВВЕДЕНИЕ
Продукция активных форм кислорода (АФК) — одна из важных функций фагоцитов, позволяющая им осуществлять защиту организма от патогенов. Основным источником АФК, продуцируемых фагоцитирующими клетками является ЫЛОРИ-оксидаза, мембра-но-ассоциированный мультикомпонентный ферментный комплекс. Однако повышенная концентрация АФК, образующихся в местах скопления нейтрофилов, оказывает повреждающее действие и на собственные ткани организма. Ранее нами было показано, что внеклеточная форма БТШ70 может быть одним
Адрес: 117997, Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10, ИБХ РАН. E-mail: natywa@list.ru
из эндогенных факторов, ответственных за подавление избыточной продукции АФК [1].
БТШ70 относятся к суперсемейству стресс-индуцируемых белков теплового шока, выполняющих протективные и шаперонные функции [2]. В последние годы появляется все больше свидетельств присутствия в сыворотке крови человека и лабораторных животных циркулирующего пула БТШ70 [3]. Было также показано, что содержание сывороточных БТШ70 значительно возрастает при ряде заболеваний и в условиях стресса [4]. Мало изученными остаются источники и функции, а также причины и механизмы секреции внеклеточных БТШ70. Установлено, однако, что внеклеточные БТШ70 обладают уникальными иммуномодулирующими свойствами [5, 6]. Ранее нами была продемонстрирована
способность экзогенных БТШ70 подавлять амплитуду «окислительного взрыва» (ОВ) нейтрофилов человека в модели фагоцитоза этими клетками опсонизированного зимозана [1]. В дальнейшем этот эффект, а также возможность взаимодействия БТШ70 с NADPH-оксидазой, были продемонстрированы в работах других авторов [7, 8]. Однако механизмы регулирующего действия внеклеточных БТШ70 на продукцию АФК фагоцитами остаются неизученными. Существует гипотеза, что этот эффект может быть результатом прямого взаимодействия БТШ70 с компонентами NADPH-оксидазы [9]. Для оценки такой возможности в данной работе в ряде моделей было исследовано влияние БТШ70 на процессы спонтанной и индуцированной генерации АФК в присутствии ингибиторов ферментативной активности NADPH-окси-дазы.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Все реактивы приобретались в Sigma, США, кроме Polymorohprep (Axis-Shield, Норвегия), апоцинина (Calbiochem, Германия), БТШ70 (StressMarq, Канада).
Получение клеточных суспензий. Клетки костного мозга (КМ) мыши вымывали из полых костей самок мышей BALB/c («Анд-реевка», Россия) фосфатным буфером (PBS). Эритроциты удаляли с помощью лизирущего буфера. Нейтрофилы выделяли из клеток КМ мыши методом отрицательной магнитной селекции с помощью набора Neutrophil Isolation Kit (Miltenyi Biotec, Германия) согласно рекомендациям производителя. Нейтрофилы человека выделяли из периферической крови доноров с помощью разделяющей среды Polymorphprep следуя рекомендациям производителя.
Регистрация АФК. Измерение общего и внеклеточного уровня АФК проводили методом люминол- и изолюминол-зависимой хемилюминисценции соответственно [10]. Белки в концентрации 5 мкг/мл добавляли в лунки за 40 мин до индукции «окислительного взрыва» (ОВ). Для индукции ОВ использовали форбол 12-миристат 13-ацетат (ФМА) [11] и хемотактический пептид ^формил-Met-Ley-Phe (fMLP) [12].
Тепловой шок. В части экспериментов клетки подвергались тепловой обработке при 43 °С в течение 10 мин, после чего следовал период восстановления 1 час при 37 °С.
Ингибиторы продукции АФК. Для подавления интенсивности продукции АФК ферментным комплексом NADPH-оксидазы использовали ингибитор его цитозольной субъединицы p47phox апоцинин [13] в концентрации 10 мкМ и ингибитор флавин-содержащих ферментов Diphenyleneiodo-nium — DPI [14] в концентрации 1 мкМ. Ингибиторы вносили в образцы клеток за 15 минут до добавления белков.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
На клетках КМ была продемонстрирована дозозависимая индукция ОВ ФМА и fMLP. Оптимальные дозы активаторов составили 5 нг/мл ФМА и 10 мкМ fMLP. В предварительной части исследования было также показано, что тепловая обработка клеток КМ приводит к заметному снижению ФМА-индуцируемой продукции АФК.
Эксперименты по предобработке клеток КМ экзогенными БТШ70 подтвердили дозо-и время-зависимое ингибирующее действие этих белков на продукцию АФК. Так, полученные результаты показали, что добавление к образцам клеток КМ экзогенных БТШ70 в концентрации 1 мкг/мл и выше значительно снижает ФМА-индуцированный ОВ даже после 5-минутной инкубации. При инкубации клеток с БТШ70 в течение 40 мин уменьшение амплитуды ОВ наблюдается при концентрации белка от 0,1 мкг/мл. Также было показано, что внесение в образцы клеток КМ экзогенного БТШ70 приводит к достоверному снижению фонового уровня продукции АФК.
В опытах c регистрацией хемилюминес-ценции с помощью люминола и его изомера изолюминола, не способного проникать через клеточные мембраны, впервые было продемонстрировано, что экзогенный БТШ70 достоверно подавляет не только продукцию АФК в окружающую среду, но и генерацию кислородных радикалов во внутриклеточном пространстве. Такое действие БТШ70 было показано и в опытах с цельными популяциями клеток КМ и с фракциями выделенных нейтрофилов КМ.
Эти данные свидетельствуют о сложной комплексной реакции фагоцитов на взаимодействие с внеклеточной формой БТШ70. Нами было показано, что добавление БТШ70 как в смешанную культуру клеток КМ, так и в обогащенную культуру нейтрофилов, приводит к снижению фонового уровня вне- и
БТШ70 подавляет синтез АФК фагоцитами
109
внутриклеточных АФК уже через 1-2 мин после внесения этого протеина. Такую быструю реакцию процессов генерации АФК внутри клетки невозможно объяснить описанным в литературе феноменом интернализации внеклеточных БТШ70 различными типами клеток. В то же время, за значительно более короткий промежуток времени (около 1 минуты) после внесения БТШ70 может произойти процесс адсорбции этого протеина на клеточной поверхности и связанные с этим возможные изменения физико-химических характеристик плазматических мембран. Также указанные изменения могут прямо повлиять на ферментативную активность сложного мембрано-ассоциированного комплекса NADPH-оксидазы, но при этом нельзя исключить, что подобные мембрано-модифицирую-щие эффекты БТШ70 способны оказывать модулирующее действие этого протеина на процессы генерации АФК во внутриклеточном пространстве.
В следующей части исследования для оценки возможного вклада взаимодействия внеклеточного БТШ70 с NADPH-оксидазой в эффекты этого протеина, мы протестировали действие БТШ70 на клетки в присутствии апоцинина — специфического ингибитора сборки мембранного комплекса NADPH-оксидазы, связывающего субъединицу p47phox. Результаты практически не различались для всех исследуемых клеточных моделей. Как и ожидалось, апоцинин существенно подавлял продукцию клетками АФК. Однако, присутствие апоцинина в образцах этих клеток не отменяло ингибирующий эффект БТШ70, что указывает на то, что антиоксидантный эффект БТШ70 достигается не за счет взаимодействия с p47phox, обеспечивающей транслокацию цитозольных субъединиц NADPH-оксидазы к плазматической мембране. Возможно, что обусловленное БТШ70 снижение активности NADPH-оксидазы связано с взаимодействием этого белка с другими субъединицами ферментного комплекса.
Еще одна серия экспериментов была посвящена анализу эффектов БТШ70 в присутствии в клеточной культуре DPI — неспецифического ингибитора флавин-содержащих ферментов, к которым относится и NADPH-окси-даза, в частности, ее субъединица gp91phox, представленная на клеточной поверхности, т.е. доступная для прямого взаимодействия с внеклеточным пулом БТШ70. DPI в наших моделях существенно подавлял фоновый уровень АФК и уровень ОВ, индуцированного
ФМА и fMLP, во всех исследуемых клеточных моделях. Полученные результаты продемонстрировали, что, как и в экспериментах с апоцинином, внесение экзогенного БТШ70 в культуры клеток, инкубируемых в присутствии DPI, приводило к снижению и общего, и внеклеточного фонового уровня продукции АФК. Как и результаты, полученные с использованием апоцинина, эти данные нельзя рассматривать как свидетельство влияния БТШ70 на активность NADPH-оксидазы, но они также не исключают обусловленности зарегистрированных эффектов экзогенных БТШ70 взаимодействием с некоторыми субъединицами данного
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.