БИОХИМИЯ, 2015, том 80, вып. 9, с. 1344 - 1355
УДК 577.241
ВНЕКЛЕТОЧНЫЕ микроРНК Обзор
© 2015 Ю.А. Макарова12*, М.Ю. Шкурников23, А.А. Турчинович4, А.Г. Тоневицкий3, А.И. Григорьев5
1 Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН, 119991 Москва; факс: +7(495)135-1405, электронная почта: j-makarova@yandex.ru
2 ООО Научно-технический центр «БиоКлиникум», 115088 Москва; факс: +7(495)665-6189, электронная почта: mail@bioclinicum.com
3МНИОИ им. П.А. Герцена - филиал ФГБУ«НМИРЦ» Минздрава РФ, 125284Москва; факс: +7(495)945-8020, электронная почта: info@mnioni.ru
4 Molecular Epidemiology Group, German Cancer Research Center, Germany; fax: +49(0)6221-422995, E-mail: a.turchinovich@dkfz-heidelberg.de
5 ГНЦРФ, Институт медико-биологических проблем РАН, 123007 Москва; факс: +7(499)195-2253, электронная почта: grigoriev@imbp.ru
Поступила в редакцию 19.02.15 После доработки 31.03.15
Обнаружение miPHK в плазме крови и других биологических жидкостях привело к представлению о том, что некодирующие РНК животных могут служить внеклеточным переносчиком сигнала. Обсуждается текущее состояние исследований в данной области, в частности, способность miPHK переносить информацию между клетками in vitro и in vivo; возможность использования внеклеточных miPHK в качестве маркеров для диагностики широкого спектра заболеваний, а также необходимость совершенствования и стандартизации существующих методик выделения внеклеточных miPHK.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: miPHK, экзосомы, РНК-маркеры, некодирующие РНК, онкогенез.
М1РНК составляют одно из самых многочисленных семейств некодирующих РНК. Число описанных ш1РНК человека превысило 2000 и продолжает расти (http://mirbase.org). М1РНК участвуют в регуляции экспрессии генов и вовлечены во множество процессов в организме, например, в пролиферацию и дифференциров-ку клеток, апоптоз и различные метаболические пути [1, 2]. По существующим оценкам, ш!РНК регулируют экспрессию более 60% генов белков [3]. Многие патологические процессы, в том числе онкологические заболевания, сопровождаются нарушениями экспрессии ш!РНК [4].
В 2007 г. было обнаружено, что Ш1РНК, сек-ретированные одним типом клеток, могут переноситься в другие типы клеток [5]. Вскоре
Принятые сокращения: c-miPHK (circulating microRNA) — внеклеточные микроРНК; HDL (high-density lypoproteins) — липопротеиды высокой плотности; РНП — рибонуклеопротеид.
* Адресат для корреспонденции.
miPHK были найдены в плазме крови [6—8] и, позже, в других биологических жидкостях [9—14]. Такие данные позволили предположить, что внеклеточные miPHK (circulating miRNA, c-miPHK) являются новым типом переносчика сигнала между различными клетками и органами. Это открыло новую страницу в представлениях о межклеточной коммуникации и регуляции процессов в организме животных (ранее подобные наблюдения были сделаны для растений). с-miPHK могут оказаться намного более специфичными регуляторами, чем гормоны или цитокины, и влиять на более широкий спектр процессов. Состав c-miPHK меняется при различных физиологических и патологических состояниях организма и потому в настоящее время интенсивно исследуется возможность применения c-miPHK в качестве высокоспецифичных маркеров, позволяющих производить неинва-зивную диагностику [15, 16]. Hиже обсуждается текущее состояние исследований в данной области. Особое внимание уделено необходимости
совершенствования и стандартизации существующих методов исследования с-miPHK.
ПРОЦЕССИНГ И ФУНКЦИИ miРНК
Гены miPHK могут представлять собой самостоятельные транскрипционные единицы или располагаться в интронах генов белков, а также в интронах и экзонах генов некодирую-щих РНК и иногда в экзонах генов белков [17, 18]. Гены miPHK транскрибируются PHK-поли-меразой II в составе длинных кепированных и полиаденилированных предшественников (primary miPHK, pri-miPHK) [19, 20]. Гены некоторых miPHK, расположенные к З'-концу от повторов Alu, транскрибируются PHK-полимера-зой III [21]. Pri-miPHK имеют в своем составе шпильку длиной ~70 н. (pre-miPHK), содержащую последовательность зрелой miPHK. Pre-miPHK вырезаются из предшественника PHKазой III Drosha в комплексе с PHK-связывающим белком DGCR8 [22] и с помощью белка Exportin5 транспортируются в цитоплазму [23], где подвергаются дальнейшему процессингу с участием PHKазы III Dicer в комплексе с PHK-связываю-щим белком TRBP. Образующиеся ~22 н. двух-цепочечные молекулы ассоциируют с белком семейства Ago, который является основным компонентом белкового комплекса, названного RISC (RNA-induced silencing complex). Одна из цепей дуплекса деградирует, а зрелая miPHK в составе RISC может комплементарно взаимодействовать с мPHK-мишенью. За редкими исключениями, комплементарность между ними неполная, а потому разрезания мPHK по механизму PHK-интерференции обычно не происходит. Более того, из четырех присутствующих у человека белков семейства Ago нуклеазной активностью, необходимой для разрезания мPHK, обладает только один — Ago2. Поэтому для ин-гибирования экспрессии необходимо участие дополнительных белков, в частности, белка GW182, который ассоциирует с комплексом RISC [24] и рекрутирует белки, осуществляющие репрессию трансляции или деаденилирова-ние и деградацию мPHK [1, 2]. Обнаружено, что miPHK имеют и другие, «неканонические» функции: они могут вызывать усиление трансляции мPHK [25] и осуществлять транскрипционный сайленсинг генов [26].
В большинстве случаев участки связывания miPHK расположены в З'-нетранслируемых областях мPHK, хотя иногда могут располагаться в кодирующей последовательности [27] и 5'-не-транслируемых областях [28—29]. Благодаря своей
малой длине и неполной комплементарности с мРНК каждая ш1РНК может иметь сотни мишеней [30]. С другой стороны, мРНК, как правило, имеет несколько участков связывания для одной и той же или для разных ш1РНК, что позволяет осуществлять комплексную регуляцию трансляции, которая может быть различной в разных типах клеток [3].
В каждом типе клеток экспрессируется, как правило, 200—600 ш1РНК, и каждый тип клеток имеет свой собственный профиль экспрессии ш1РНК. Например, профили экспрессии различаются у разных видов лейкоцитов [31—33]. Большинство ш1РНК экспрессируется в широком спектре тканей и только некоторые имеют выраженную тканеспецифичную экспрессию [34].
ВНЕКЛЕТОЧНЫЕ miРНК МОГУТ БЫТЬ АССОЦИИРОВАНЫ С РАЗНЫМИ НОСИТЕЛЯМИ
К настоящему времени miPHK обнаружены вне клеток в составе различных биологических жидкостей, в частности, в плазме и сыворотке крови, молоке, слезах, слюне, моче, амниоти-ческой, семенной и спинномозговой жидкостях и асцитах [6, 9—14]. Оказалось, что они весьма стабильны: не подвержены действию РНКаз, устойчивы к замораживанию и значительным колебаниям рН; их концентрация не меняется при длительном инкубировании плазмы при комнатной температуре [7, 35, 36]. Такая стабильность объясняется тем, что miPHK ассоциированы с различными носителями. Это могут быть разнообразные везикулы, секретируемые клетками. Так, почти все типы клеток способны образовывать мембранные пузырьки, отделяемые непосредственно плазматической мембраной, т.н. микровезикулы (microvesicles, microparticles: у данного термина есть много синонимов [37]) (рисунок). Их размер составляет ~100 нм—1 мкм. Помимо этого, клеточные эндосомы способны образовывать инвагинации с последующим образованием внутриэндосомальных везикул. В результате образуются т.н. мультивезикулярные тельца (multivesicular bodies). Впоследствии такая эндосома может сливаться с плазматической мембраной, в результате чего содержавшиеся в ней везикулы, называемые экзосомами, высвобождаются во внеклеточное пространство (рисунок) [38, 39]. Экзосомы имеют размер ~40—100 нм (следует отметить, что такой же термин используется в совершенно другой области клеточной биологии для обозначения комплекса экзорибонуклеаз, осуществляющих процес-
синг 3'-концов ряда РНК [40]). Помимо этого, во внеклеточной среде присутствуют т.н. апоп-тозные тельца — везикулы размером ~1—4 мкм, образовавшиеся в результате программируемой клеточной смерти [41]. Все эти везикулы могут содержать miPHK, ассоциированные с белками Ago [42, 43]. miPHK обнаружены также в комплексе с липопротеидами высокой плотности (high-density lipoprotein, HDL) [44], размер которых составляет ~9—12 нм. Наконец, фракция
miPHK присутствует во внеклеточной среде только в комплексе с белками Ago и, возможно, с белком нуклеофозмином 1 (nucleophosmin 1) [45], причем в состав этой фракции входит, вероятно, ~90% всех внеклеточных miPHK [35, 46] (рисунок). Получены указания на то, что некоторые виды miPHK преимущественно локализованы в везикулах, тогда как другие обнаружены главным образом в составе несвязанных с везикулами комплексах с Ago [46].
Пути секреции miPHK
Выделение разных фракций с-miPHK представляет довольно сложную экспериментальную задачу. Так, размер апоптозных телец соответствует размеру тромбоцитов и сопоставим с размерами клеток крови. Поэтому вопрос о том, относить ли вообще miPHK из апоптозных телец к внеклеточным miPHK, является дискуссионным. По крайней мере, отделить их от тромбоцитов и фрагментов разрушенных в ходе экспериментальных процедур клеток с использованием традиционно применяемого для выделения с-miPHK центрифугирования невозможно. Еще одной пока неразрешенной проблемой остается разделение микрочастиц и экзосом. В полной мере разделить их в настоящее время не представляется возможным, поскольку их размеры могут быть очень близкими, а универсальные белковые маркеры, специфичные для каждого из типов частиц и встречающиеся во всех типах клеток, пока не обнаружены [47]. В работах, посвященных данной теме, экзосомами, как правило, называют фракцию везикул, полученную в результате ультрацентрифугирования (~100 000 g). Таким образом, на сегодняшний день в данной области термин «экзосома» имеет различное смысловое содержание: во-первых, его используют, подразумевая путь образования этих частиц, во-вторых, обозначают способ их выделения и, наконец, термин продолжает использоваться в более широком смысле, обозначая любые сек
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.