БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ, 2008, том 34, № 3, с. 317-321
УДК 577.152.34414:616-092
ВНЕКЛЕТОЧНЫЕ ПРОТЕИНАЗЫ МИЦЕЛИАЛЬНЫХ ГРИБОВ КАК УЧАСТНИКИ ПРОЦЕССА ПАТОГЕНЕЗА
© 2008 г. Я. Е. Дунаевский*#, Ä. Р. Матвеева**, Г. Н. Фатхуллина**, Г. Ä. Белякова**, Т. М. Коломиец***, Е. Д. Коваленко***, М. Ä. Белозерский*
*НИИ физико-химической биологии им. АН. Белозерского Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова, 119992, Москва, Воробьевы горы; **Биологический факультет Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова, Москва;
*** ВНИИ фитопатологии РАСХН, Москва Поступила в редакцию 02.07.2007 г. Принята к печати 19.07.2007 г.
Интерес к протеиназам, секретируемым мицелиальными грибами, обусловлен рядом причин, среди которых одна из важнейших связана с их участием в инициации и развитии патогенного процесса. При сравнении сапротрофных видов мицелиальных грибов с фитопатогенными удалось выявить характерную особенность - появление у фитопатогенов новой трипсиноподобной активности, отсутствующей у сапротрофов. Для выяснения вопроса, существует ли связь между степенью патогенности гриба и уровнем активности секретируемой трипсиноподобной протеиназы, проведено сравнение разных видов Fusarium, различающихся степенью патогенности. У двух из них, F. sporotrichioides и F. het-erosporum, ржаной (фузариоз колоса) и пшеничной (корневая гниль), была обнаружена четкая корреляция активности с патогенностью, то есть более патогенный F. sporotrichioides секретировал заметно более высокую внеклеточную трипсиноподобную активность, чем менее патогенный вид F. heterosporum. Таким образом, в паре сапротроф-патоген наличие трипсиноподобной активности может являться показателем патогенности гриба, а в ряде случаев величина этой активности может указывать и на степень его патогенности. Можно предположить, что специфичные для фитопатогенов трипсиноподобные протеиназы непосредственно участвуют в патогенном процессе, возможно, путем взаимодействия со "сторожевым" белком или продуктом гена устойчивости.
Ключевые слова: патогенез, протеиназа, сапротроф, секреция, фитопатоген.
ВВЕДЕНИЕ
Протеолитические ферменты играют исключительно важную роль в регуляции различных биологических процессов на молекулярном, клеточном, тканевом или межорганном уровнях. Функции протеиназ в организме весьма разнообразны: от контроля за концентрацией индивидуальных белков до трансформации биологической активности через активацию или инактивацию физиологически активных белков и пептидов [1-4]. Однако, хотя все протеиназы осуществляют гидролиз белков, функциональные задачи, выполняемые различными группами ферментов, могут заметно различаться. Внеклеточные протеиназы, секретируемые различными микроорганизмами, и, в частности, мицелиальными грибами, характеризуются определенным набором специфических функций [5]. Интерес к этим ферментам заметно возрос в настоящее время, что во многом связано
Сокращения: СП- и ТП-протеиназы - субтилизиноподоб-ные и трипсиноподобные протеиназы; pNA - пара-нитро-анилид.
#Автор для связи (тел.: (495) 939-55-51; факс: (495) 939-31-81; эл. почта: dun@belozersky.msu.ru).
как с ухудшающимися экологическими условиями, так и появлением значительного числа людей с ослабленной иммунной системой. Интерес к протеиназам носит не только коммерческий характер (использование их для нужд различных видов производств - от медико-фармацевтических до пищевых) [6], но и научный, что обусловлено выяснением их роли в патогенезе с целью последующего подавления или ослабления патогенного процесса путем регуляции активности протеиназ, участвующих в этом процессе [7-9]. Патогенный процесс у людей с ослабленной иммунной системой может быть запущен обычными микромицетами, присутствующими в окружающей среде (в воде, почве, на органических остатках) и никогда ранее не рассматривавшимися в качестве возбудителей болезней. У секрети-руемых этими грибами протеиназ могут появляться новые биологические функции, поддерживающие нападение гриба на ткани организма хозяина или защищающие гриб путем инактивации в среде вредных для него веществ.
Настоящая работа посвящена сравнительному изучению секретируемых протеиназ, специфич-
Активность, ед./г сухого мицелия
Рис. 1. Главные протеиназы - трипсиноподобные (1) и субтилизиноподобные (2), секретируемые различными микромицетами.
Активность, ед.
ных для патогенного процесса, у различных видов грибов, отличающихся по степени патогенности.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Среди преобладающих эндопептидаз в спектрах внеклеточных ферментов различных видов мицелиальных грибов были охарактеризованы две протеиназы, одна из которых активна по отношению к субстрату Glp-Ala-Ala-Leu-pNA, а другая - к субстрату Bz-Arg-pNA. На основании физико-химических свойств, субстратной специфичности и данных ингибиторного анализа эти ферменты могут рассматриваться соответственно как субтилизи-ноподобная (СП) и трипсиноподобная (ТП) протеиназы [10-12]. Сравнительное изучение внеклеточных протеиназ у шести различных видов мицелиальных грибов, из которых три являлись фитопатогенами (Alternaría alternata, Botrytis cinerea, Ulocladium botrytis), а три - сапротрофами (Penicillium chrysogenum, P. terlikowskii, Trichoder-ma harzianum), показало, что СП-протеиназа присутствует у всех изученных видов грибов, тогда как ТП-протеиназа - только у фитопатогенов (рис. 1).
Уровни секреции этих двух протеолитических активностей существенно различались в случае присутствия в среде белкового субстрата. Так, присутствие в среде белка, причем в довольно больших количествах (1%), индуцировало появление ТП-протеиназы в культуральной жидкости, в то время как невысокий базовый уровень активности СП-протеиназы в среде часто определялся и в отсутствие белкового субстрата, а для достижения максимума этой активности было достаточно 0.1% белка (рис. 2). Следует заметить, что и максимальное накопление двух исследуемых активностей, секретируемых грибами, достигается
Рис. 2. Влияние концентраций казеина в среде культивирования на активности внеклеточных протеиназ микромицетов: трипсиноподобных (1) и субтилизино-подобных (2).
в разное время культивирования: на 4-5-е сутки роста культуры для СП-протеиназы и на 6-8-е сутки для ТП-протеиназы. Этот временной сдвиг может объясняться тем, что появляющаяся первой СП-протеиназа выполняет менее специфичные, но общие для всех грибов функции, которые заключаются в обеспечении проникновения гиф гриба в клетки растения-хозяина и гидролиза макромолекулярных субстратов, тогда как специфичная для патогенов ТП-протеиназа участвует непосредственно в патогенном процессе, возможно, путем взаимодействия со "сторожевым" белком [13, 14] или продуктом гена резистентности [15, 16]. Можно предположить, что СП-протеиназа, появляясь первой, обеспечивает условия, необходимые для последующего действия ТП-протеи-назы, в частности, облегчает ее проникновение в растительную ткань. Сходное последовательное появление ферментов наблюдалось у энтомопа-тогена Metarhizium anisopliae, где секреция протеиназы предшествовала появлению экзохитиназы, эндохитиназы и липазы [17]. Деградация кутику-лярных белков с последующей модификацией структуры кутикулы давала возможность хитина-зам и липазам, секретируемым позднее, получить доступ к их субстратам.
Для выяснения вопроса, существует ли связь между степенью патогенности гриба и уровнем активности секретируемой ТП-протеиназы, проводили сравнение разных видов Fusarium, различающихся степенью патогенности. У двух форм двух видов Fusarium, F. sporotrichioides и F. het-
erosporum, ржаной (фузарноз колоса) и пшеничной (корневая гниль), была обнаружена четкая корреляция активности с патогенностью, то есть более патогенный F. sporotrichioides секретиро-вал заметно более высокую внеклеточную ТП-активность, чем менее патогенный вид F. het-erosporum (рис. 3). Эта тенденция сохранялась при расчете активности на сухой вес мицелия, что может указывать на целенаправленный синтез и секрецию внеклеточной ТП-протеиназы у видов с более высоким уровнем патогенности.
Однако при дальнейшем расширении числа видов и штаммов Fusarium, взятых для анализа корреляции величины секретируемой протеолитической активности со степенью патогенности, выявилась некоторая несогласованность. Два штамма F. ox-ysporum оказались хорошими продуцентами трипсиноподобной активности, но при этом слабыми патогенами. Возможно, это связано с тем, что используемые тест-системы для выявления патогенности (количество проросших семян и время их прорастания, длина корней проростков и т.д.) не всегда позволяют объективно ее оценить у отдельных видов грибов [18]. Так, если сравнение патогенности ржаных форм как F. sporotrichioides, так и F. heterosporum, выявило полное совпадение результатов в двух тест-системах, то сравнение патогенности пшеничных форм Fusarium показало незначительные различия между видами при тестировании прорастания семян и заметную разницу при измерении длины корней проростков (таблица).
Таким образом, в паре сапротроф-патоген наличие трипсиноподобной активности может являться показателем патогенности мицелиального гриба, а в ряде случаев величина этой активности может указывать и на степень его патогенности. Последнее верно не всегда, что может быть связано с тем, что, во-первых, заражение растения патогеном является сложным процессом, в котором задействованы различные комплексы соединений; их действие часто перекрывается и смазывает картину "чистого" влияния секретируемых протеиназ на процесс инфицирования. А, во-вторых, возможно, что используемый в наших исследованиях способ определения патогенности не связан напрямую с величиной внеклеточной активности протеиназ, и следует подобрать более удобную и показательную тест-систему. Возможно, более точной будет корреляция между величиной внеклеточной активности фермента и одним из свойств патогенности гриба, а именно агрессивностью, составляющей основу его паразитической деятельности и определяемую количеством спор, необходимых для заражения, быстротой обоснования патогена в растении и длите
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.