научная статья по теме ВНУТРИКЛЕТОЧНЫЙ АППАРАТ ПОДВИЖНОСТИ ГАЛОАРХЕЙ. ЭЛЕКТРОННО-МИКРОСКОПИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Биология

Текст научной статьи на тему «ВНУТРИКЛЕТОЧНЫЙ АППАРАТ ПОДВИЖНОСТИ ГАЛОАРХЕЙ. ЭЛЕКТРОННО-МИКРОСКОПИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ»

БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕМБРАНЫ, 2008, том 25, № 6, с. 434-440

УДК 577.152; 579.236; 579.841.51

ВНУТРИКЛЕТОЧНЫЙ АППАРАТ ПОДВИЖНОСТИ ГАЛОАРХЕЙ. ЭЛЕКТРОННО-МИКРОСКОПИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

© 2008 г. В. В. Сперанский, Т. М. Новикова, А. Л. Метлина

Научно-исследовательский институт физико-химической биологии им. АН. Белозерского Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова, 119991 Москва; факс: (495)939-31-81; электронная почта: metlina@belozersky.msu.ru Поступила в редакцию 24.03.2008 г. После доработки 10.06.2008 г.

Методом электронной микроскопии проведено изучение структуры обнаруженной нами ранее в аппарате подвижности Halobacterium salinarum внутриклеточной дискообразной пластинчатой структуры (ДПС), а также детали включения в нее проксимальных концов жгутиков. Анализ результатов, в том числе полученных после фиксации срезов с помощью перманганата калия, позволяет предположить, что ДПС, отсутствующая у бактерий, включает мембраноподобное образование. Электронно-микроскопические фотографии "теней" клеток, полученных мягким разрушением их при снижении концентрации NaCl, позволили изучить детали как структуры самой ДПС, так и способа базирования на них проксимальных концов жгутиков. Обсуждается организация аппаратов подвижности бактерий и архей как двух представителей отдельных доменов.

Согласно современным представлениям, живущие на Земле организмы представлены тремя доменами - Archaea, Bacteria и Eukaryote [1]. Бактерии и археи передвигаются в среде при помощи специальных органелл - жгутиков, внешне похожих, но фундаментально различных двигательных аппаратов [2, 3]. К настоящему времени получено много информации о двигательном аппарате бактерий - бактериальных жгутиках (БЖ), в том числе латеральных и полярных жгутиках одной и той же клетки (Vibrio) и периплазматических жгутиках спирохет [3-7]. БЖ состоит из трех основных частей - внутриклеточного базального тела, крюка и длинной наружной нити, состоящей из субъединиц белка флагеллина. Опыты с "привязыванием" живых бактериальных клеток за жгутик к стеклу при помощи антител [8] впервые продемонстрировали вращение БЖ в клетке. В дальнейшем было установлено, что базальное тело, встроенное в цито-плазматическую мембрану (ЦМ), представляет собой особого рода мотор, энергетическим источником работы которого является трансмембранный потенциал ионов водорода [9-11] или натрия [12, 13]. БЖ, вращаясь вокруг своей оси, создает гидродинамическую силу, позволяющую клеткам направленно двигаться в среде.

Информация об аппарате подвижности архей ограничена. К настоящему времени стало очевид-

Сокращения: ЖА - жгутики архей; БЖ - бактериальные жгутики; ДПС - дискообразная пластинчатая структура; ЦМ - цитоплазматическая мембрана.

ным, что жгутики архей (ЖА), несмотря на их внешнее сходство с БЖ, имеют принципиальные различия [2, 3, 14, 15]. Нить ЖА, в отличие от БЖ, имеет мультифлагеллиновый состав, их флагелли-ны гликозилированы, сборка происходит с проксимального конца отличным от БЖ способом. Ограничены данные о структурных компонентах ЖА, а также отсутствует гомология в генах, кодирующих белки и системы сборки БЖ и ЖА [2, 15]. Механизм функционирования ЖА также пока неясен [16], поскольку их вращение за счет трансмембранного градиента ионов водорода, подобно БЖ, наблюдали только у На1оЪа^епит salinarum (ранее НЬ. НаОЪшт) [17, 18] и так называемых "квадратных" архей На1оагси1а [19, 20].

В работе 1984 г., положившей начало интенсивному изучению свойств двигательного аппарата архей, Алам и Остерхельт [17] показали, что полярный пучок жгутиков НЪ. На1оЪшт ведет себя как единое целое. Они впервые предположили, что проксимальные концы жгутиков в области вхождения их в клетку объединены некоей обширной цитоплазматической структурой [17]. В 1992 г. нам впервые удалось экспериментально подтвердить это предположение при изучении ультратонких серийных срезов клеток НЪ. заИпагит и идентифицировать в области вхождения пучка жгутиков в клетку структуру типа платформы, названную нами дискообразной пластинчатой структурой (ДПС) [21].

В представленной работе приведены результаты электронно-микроскопического изучения

структуры и свойств как самой ДПС, так и деталей включения в нее проксимальных концов жгутиков.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Бактериальные культуры. Большая часть экспериментов проведена на галоархеях Hb. sali-narum B-1231. В отдельных опытах использована культура Hb. halobium Flx3 (в настоящее время Hb. salinarum). Клетки выращивали на среде, содержащей: NaCl - 250 г/л, MgSO4 ■ 7H2O - 20 г/л, KCl - 2 г/л, цитрат Na - 3 г/л, пептон - 10 г/л, дрожжевой экстракт - 1 г/л; рН 7.2-7.4. Подвижные клетки отбирали методом культивирования на полужидком агаре (0.3%). Процедуру повторяли трижды.

Электронная микроскопия. Негативное контрастирование препаратов проводили 2% раствором фосфорновольфрамовой кислоты (рН 7.0). В качестве "увлажняющего агента" в отдельных опытах использовали бычий сывороточный альбумин (0.1%). Для получения срезов галоархеи фиксировали 4-5% глутаровым альдегидом на ка-кодилатном буфере, содержащем 20-25% NaCl. Постфиксацию проводили в 1-2% четырехокиси осмия на веронал-ацетатном буфере. Материал обезвоживали этанолом в возрастающих концентрациях, промывали ацетоном и заливали в эпон-812. "Тени" галоархейных клеток получали путем разбавления клеточной суспензии непосредственно перед фиксацией до концентрации 10-15% NaCl. Ультратонкие срезы толщиной 60-80 нм приготовлены на ультрамикротоме LKB-III (Швеция), смонтированы на бленды с формваровой подложкой и окрашены цитратом свинца по Рей-нольдсу [22]. Контрастирование срезов 2% водным раствором уранилацетата перед окрашиванием препаратов цитратом свинца способствовало получению более качественных фотографий. Контрастирование клеток перманганатом проведено согласно [23, 24]. Препараты просматривали и фотографировали на микроскопах Hitachi HU-11B и HU-12 (Япония) при ускоряющем напряжении 75 кВ.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Ультратонкие срезы интактных клеток. Ранее на срезах клеток НЬ. salinarum в области прохождения жгутиков непосредственно через клеточную стенку и ЦМ у галоархей мы не обнаружили никаких специализированных структур, аналогичных дискам БЖ. Вместе с тем на препаратах отчет-

ливо было видно, что жгутики данных галоархей значительно глубже погружены в цитоплазму, чем у бактерий, а их основания связаны вместе сложной структурой, ранее на препаратах бактерий не наблюдаемой [21] (рис. 1). Анализ срезов показал, что это образование представляет собой поперечное сечение пластинки дисковидной формы, всегда расположенной точно в месте вхождения пучка жгутиков в клетку на расстоянии ~20 нм от мембраны. Данная электронно-плотная линия видна в среднем на пяти-шести последовательных срезах толщиной 60-70 нм (при этом ее размеры уменьшаются от центрального среза к периферийным) [21]. Своей максимальной протяженности она достигает на срединных срезах. Эта новая структура в клетках НЬ. salinarum названа нами ДПС [21, 25, 26].

При большом увеличении (рис. 16) на срезе видно, что ДПС обладает неодинаковым сродством к четырехокиси осмия. В ее составе отчетливо различимы два электронно-плотных осмиофильных слоя, разделенных светлым неокрашенным промежутком. Морфология этих слоев и их расположение напоминает мембраны, фиксированные че-тырехокисью осмия [27]. Следует отметить, что характерная трехслойная структура клеточных мембран, фиксированных четырехокисью осмия, бывает отчетливо видна только при прохождении среза строго поперек мембраны. В иных случаях проекции электронно-плотных слоев накладываются один на другой в пределах среза, и мембрана выглядит как сплошная темная линия. В нашей работе серийные срезы материала строго поперек ДПС получались редко. Поэтому, в основном, на фотографиях структура выглядит как сплошная линия.

На некоторых срезах ДПС хорошо видна на фоне внутриклеточного содержимого (рис. 2а), и, кроме того, в ее структуре отчетливо просматриваются утолщения, соответствующие, по всей видимости, местам включения в ДПС проксимальных концов жгутиков (рис. 26).

Фиксация клеток перманганатом калия. Известно, что одним из принципов изучения тонкой структуры биологических объектов методом электронной микроскопии является сопоставление результатов, полученных при применении различных способов приготовления препаратов. Взаимодействие ряда фиксаторов и контрастирующих веществ с белками, липидами, углеводами, нуклеиновыми кислотами, образующими субклеточные упорядоченные структуры, изучено достаточно подробно [23, 28, 29]. Поэтому сравнение результатов применения разных фиксирующих веществ и контрастеров позволяет делать вполне опреде-

ленные выводы относительно природы изучаемых структур.

Мы провели эксперименты по фиксации клеток НЪ. заНпагит перманганатом калия (0.5%) (рис. 3). Видно, что в случае галоархей этот фиксатор сам по себе, без префиксации альдегидом, не обеспечивает удовлетворительной сохранности структур цитоплазмы. Тем не менее на полюсах клеток отчетливо видны ДПС, фиксировано расположенные параллельно ЦМ на обоих полюсах клеток как и при традиционной фиксации глутаро-вым альдегидом - четырехокисью осмия. При таком способе фиксации ДПС обнаруживает сходство с ЦМ и мембранными структурами других объектов [28].

Мягкое разрушение клеток снижением концентрации ШС1. Подробности организации полярных структур плохо различимы в интактных, заполненных электронноплотным материалом клетках. В подобных случаях обычно применяют различные способы мягкого разрушения клеток с тем, чтобы в большей или меньшей степени избавиться от содержимого. Мы получили срезы так называемых "теней" клеток без их внутреннего содержимого, используя высокую чувствительность галоархей к снижению концентрации №С1.

На начальном этапе лизиса при снижении концентрации соли до 3-3.5 М наблюдалось вымывание цитоплазмы из клеток в процессе обработки препаратов для электронной микроскопии. При дальнейшем снижении концентрации соли происходило частичное, а затем и полное разрушение клеток. При одном и том же режиме фиксации клетки НЪ

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком