МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 2011, том 45, № 5, с. 884-891
МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ КЛЕТКИ
УДК 577.29
ВНУТРИЯДЕРНАЯ ЛОКАЛИЗАЦИЯ р-КАТЕНИНА НЕ МОЖЕТ СЧИТАТЬСЯ ДОСТАТОЧНЫМ УСЛОВИЕМ ДЛЯ АКТИВНОСТИ КАНОНИЧЕСКОГО СИГНАЛЬНОГО ПУТИ WNT В КЛЕТОЧНЫХ ЛИНИЯХ МЕЛАНОМЫ ЧЕЛОВЕКА
© 2011 г. К. В. Куликова1*, А. В. Посвятенко1, Н. В. Гнучев1, Г. П. Георгиев1,
А. В. Кибардин1, 2, С. С. Ларин1
Институт биологии гена Российской академии наук, Москва, 119334 2Университет Осло, Центр медицинских исследований в России, Москва, 119334 Поступила в редакцию 11.03.2011 г. Принята к печати 30.03.2011 г.
Меланома представляет собой онкологическое заболевание, поздние стадии которого практически не поддаются лечению. Множество данных свидетельствует в пользу того, что не последнюю роль в возникновении и развитии меланом играют нарушения в регуляции сигнального пути Wnt. Активация канонического пути Wnt сопровождается стабилизацией и аккумуляцией основного эффектора этого каскада — р-катенина — в ядре и цитоплазме. Мутации компонентов сигнального пути Wnt, стабилизирующие р-катенин и тем самым активирующие сигнальный путь, часто встречаются при различных видах опухолей, но для меланом подобные мутации крайне редки. Тем не менее, как в опухолевом материале, так и в клеточных линиях меланомы довольно часто наблюдают накопление р-катенина в ядре и цитоплазме. Цель нашего исследования состояла в выявлении взаимосвязи между локализацией р-катенина в клеточных линиях меланомы человека и статусом активности канонического сигнального пути Wnt в этих клеточных линиях. Десять клеточных линий меланомы человека охарактеризованы на основании следующих параметров: наличия экспрессии гена лиганда канонического сигнального пути Wnt, внутриклеточного распределения р-катенина и статуса активности этого сигнального пути. Показано, что внутриклеточную локализацию р-ка-тенина нельзя считать достаточным условием активности канонического сигнального пути Wnt в клеточных линиях меланомы человека. Более того, в большинстве клеточных линий, для которых показана ядерная локализация р-катенина, канонический сигнальный путь Wnt не удалось активировать путем экзогенной экспрессии соответствующего лиганда. Клеточные линии меланомы человека отличаются как по активности канонического сигнального каскада Wnt, так и по механизмам его регуляции. Так что разработка потенциальной противоопухолевой терапии, нацеленной на данный сигнальный путь, требует знания "молекулярного портрета опухоли" — для локализации дефекта в сигнальном каскаде каждого конкретного случая.
Ключевые слова: сигнальный путь Wnt, меланома, р-катенин.
NUCLEAR р-CATENIN LOCALIZATION IS NOT SUFFICIENT FOR CANONICAL WNT SIGNALING ACTIVATION IN HUMAN MELANOMA CELL LINES, by K. V. Kulikova1*, A. V. Posvyatenko1, N. V. Gnuchev1, G. P. Georgiev1, A. V. Kibardin1'2**, S. S. Larin1 ^Institute of Gene Biology, Russian Academy of Sciences, Moscow, 119334 Russia, *e-mail: kulikova@genebiology.ru; 2University of Oslo, Center for Medical Studies, Moscow, 119334 Russia; **e-mail: kibardin@igb.ac.ru). In most cases, advanced stages of melanoma are practically incurable due to high metastatic potential of tumor cells. Multiple observations support the idea that aberrations in Wnt signaling pathway play a significant role in melanoma development and progression. Canonical Wnt signaling activation results in stabilization and accumulation of the major effector molecule called р-catenin. Mutations promoting р-cate-nin stabilization and, thereby, activation of canonical Wnt signaling pathway are frequently found in different cancers, but rarely observed in melanomas. Nevertheless, р-catenin nuclear and cytoplasmic accumulation is the feature of many human melanoma cell lines and original tumors. That is why, the aim of the investigation was to elucidate the relation between р-catenin intracellular localization and activity status of Wnt signaling pathway in human melanoma cell lines. Ten human melanoma cell lines were characterized on the basis of the following parameters: canonical Wnt ligand expression, intracellular р-catenin localization, and activity status of canonical Wnt signaling pathway. Here, it has been demonstrated that nuclear localization of р-catenin does not always correspond to active status of canonical Wnt signaling pathway. Moreover, in the majority of cell lines with nuclear р-catenin canonical Wnt signaling can't be activated by exogenous expression of an appropriate ligand. Human melanoma cell lines differ in activity of
* Эл. почта: kulikova@genebiology.ru
canonical Wnt signaling pathway as well as in mechanisms of its regulation. Therefore, the pathway-targeted potential antineoplastic therapy requires the formation of a "molecular pattern of cancer" for localization of the defect in Wnt signaling cascade in the each case.
Keywords: Wnt signaling pathway, melanoma, ß-catenin.
Чрезмерное пребывание на солнце, термические и химические ожоги, наследственная предрасположенность — вот лишь немногие факторы, способствующие возникновению меланомы. По данным Всемирной Организации Здравоохранения (ВОЗ), в 2008 году в мире зафиксировано около 200000 случаев меланомы кожи, и этот показатель постоянно растет [1]. Среднегодовой прирост заболеваемости в мире составляет около 5% (в США — 4%, в России — 3.9%), т.е. один из самых высоких среди всех злокачественных опухолей (второй после рака легкого) [2]. Эффективность существующих методов лечения меланомы напрямую зависит от стадии заболевания. К сожалению, несмотря на возможность визуальной локализации, меланому детектируют на начальных (I—II) стадиях лишь у 62—65% пациентов, в то время как в остальных случаях приходится иметь дело с запущенной формой заболевания [3]. В результате выживаемость больных меланомой низкая. Разработка способов противоопухолевой терапии на поздних стадиях заболевания требует детального понимания молекулярных процессов, лежащих в основе прогрессии меланом.
Меланома возникает вследствие злокачественного перерождения производных клеток нервного гребня — меланоцитов. Огромное количество данных свидетельствует о том, что в подобной трансформации ключевую роль играют нарушения в регуляции сигнальных каскадов, запускаемых лигандами семейства Wnt [4—6]. Интересно, что в норме процесс созревания, позиционирования и дифференцировки будущих меланоцитов сопровождается активацией различных компонентов сигнального каскада Wnt [7, 8]. Так, например, Wntl регулирует дифференцировку меланоцитов в эмбрионе мыши [9], а экспрессия Wntll необходима для миграции клеток нервного гребня в эмбрионе Xenopus laevis [10].
На настоящий момент признано существование трех различных ветвей сигнального пути Wnt [11]. Наиболее охарактеризован так называемый канонический сигнальный путь Wnt. В отличие от двух других этот сигнальный каскад связан со стабилизацией Р-катенина. Связывание одного из Wnt-лигандов (Wnt1, Wnt3a, Wnt8) с соответствующим трансмембранным рецептором Fz (Frizzled) и корецептором из семейства LRP-5/6 приводит к активации цитоплазматического белка Dvl (Dishevelled). Активированный Dvl способствует стабилизации Р-катенина за счет ингиби-
рования образования "комплекса деструкции". В отсутствие внеклеточного лиганда цитоплазмати-ческий ß-катенин взаимодействует со специальным "комплексом деструкции", состоящим из каркасных белков АРС (Adenomatous Polyposis Coli), Axin и киназ CKI (Casein Kinase I) и GSK-3ß (Glycogen synthase kinase-3ß). Находясь в составе этого комплекса, ß-катенин подвергается GSK-3ß-зависимому фосфорилированию, что служит сигналом для его дальнейшей протеасомной деградации по убиквитин-зависимому механизму. При активации канонического сигнального пути Wnt стабилизированный ß-катенин накапливается в цитоплазме, после чего транслоцируется в ядро, где служит коактиватором транскриции таких генов, как MYC [12], PTGS2 (циклооксигеназы 2)
[13], MMP7 (матриксной металлопротеиназы 7)
[14], CCND1 (циклина D1) [15] и других. Поскольку среди мишеней канонического Wnt-каскада содержится большое количество генов, контролирующих рост и развитие клеток, конститутивная активация этого сигнального пути часто ассоциирована с различными видами опухолей [16, 17]. Так, рак кишечника сопровождается мутациями в гене супрессора опухолей APC [18] и гене AXIN2 [19]; а для гепатоцеллюлярного рака характерны стабилизирующие мутации в гене ß-кате-нина, CTNNB1 [20]. При меланоме мутации компонентов канонического сигнального каскада встречаются сравнительно редко, тем не менее, накопление ß-катенина в ядре и цитоплазме неоднократно регистрировали при этом заболевании [5, 6, 21]. Обнаружена корреляция между ядерной локализацией ß-катенина в опухолевых клетках меланомы и благоприятным прогнозом по выживаемости пациентов в долгосрочной перспективе. Предполагают, что это связано с активностью канонического сигнального пути [22].
Цель данной работы состояла в том, чтобы установить наличие взаимосвязи между ядерной локализацией ß-катенина в клеточных линиях меланомы человека и статусом активности канонического сигнального пути Wnt в этих клеточных линиях.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Клеточные культуры. Анализ статуса активности канонического сигнального пути Wnt проведен на клеточных линиях меланомы человека: MelR, MelG, MelME, MelKsen, MelKis, Mel226, MelIbr, MellL, MelP, MelSi, Mel82. Все клеточные
линии получены ранее в ходе совместной работы с Российским онкологическим центром им. Н.Н. Бло-хина и Научно-исследовательским институтом онкологии им. профессора Н.Н. Петрова [23—25]. Первичные культуры выделяли из метастатических узлов пациентов, страдающих меланомой. Все клеточные линии культивировали на среде RPMI-1640 ("HyClone", США) c добавлением 10%-ной эмбриональной бычьей сыворотки ("HyClone"), 2 мМ L-глутамина ("HyClone", США), 100 ед./мл пенициллина ("ОАО Синтез", Россия) и 100 мкг/мл стрептомицина ("ОАО Биохимик", Россия) в условиях 7% CO2, 95% влажности и при температуре 37°С.
Трансфекция, люциферазный тест и иммунобло-тинг. Клеточные линии меланомы чело
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.