ЖУРНАЛ ФИЗИЧЕСКОЙ ХИМИИ, 2015, том 89, № 4, с. 708-712
БИОФИЗИЧЕСКАЯ ХИМИЯ
УДК 541.136.3
ВОДНЫЙ ОБМЕН В КЛЕТКАХ ДРОЖЖЕЙ SACCHAROMYCES CEREVISIAE РАС Y-3137 И Y-3327 ПО ДАННЫМ ЯМР С ИМПУЛЬСНЫМ
ГРАДИЕНТОМ МАГНИТНОГО ПОЛЯ
© 2015 г. И. А. Авилова*, С. Г. Васильев*, Л. В. Римарева**, Е. М. Серба**, Л. Д. Волкова***, В. И. Волков*****
* Российская академия наук, Институт проблем химической физики, Черноголовка Московской области
** Российская академия сельскохозяйственных наук, Всероссийский научно-исследовательский институт пищевой биотехнологии, Москва *** МСХА им. К.А. Тимирязева, Российский государственный аграрный университет, Москва **** Научный центр РАН, Черноголовка Московской области E-mail.irkaavka@gmail.com Поступила в редакцию 18.03.2014 г.
Изучен процесс самодиффузии воды в клетках дрожжей $ассЬагошусез еегете1ае рас У-3137 и У-3327 методом ЯМР с импульсным градиентом магнитного поля. Обнаружены три типа воды, которые различаются коэффициентами самодиффузии: свободная, межклеточная и внутриклеточная вода. Установлено, что самодиффузия межклеточной и внутриклеточной воды носит ограниченный характер. Исходя из анализа зависимостей коэффициентов самодиффузии внутриклеточной воды от интервала между импульсами градиента магнитного поля определены размер и проницаемость клеток дрожжей с разным временем культивирования (24 часа и 48 часов).
Ключевые слова: дрожжевые клетки, самодиффузия, ЯМР с импульсным градиентом магнитного поля, проницаемость.
DOI: 10.7868/80044453715040020
В настоящее время микробиологическим объектам уделяется большое внимание. Особое место среди них занимают дрожжи 8аееИагошуее8 еегеу181ае — ключевой элемент во многих технологических процессах перерабатывающих отраслей аграрно-промышленного комплекса (спиртовой, пивоваренной, винодельческой, хлебопекарной и др.). Создание современных прогрессивных технологий для интенсификации процесса брожения диктует необходимость выделения новых физиологически активных рас дрожжей, а также разработки различных приемов и способов, позволяющих повысить эффективность сбраживания дрожжевыми клетками сырья [1].
Большую роль в интенсификации процесса брожения играет проницаемость клеток дрожжей. Как известно, штаммы дрожжей 8аееИаго-шуее8 еегеу181ае обладают способностью ассимилировать, в первую очередь, моносахариды (глюкозу, маннозу, фруктозу), частично дисахарид мальтозу и трисахарид мальтотриозу. Увеличение клеточной проницаемости способствует ускорению транспорта углеводов в клетку и дает возможность усваивать одновременно практически полностью глюкозу и фруктозу, мальтозу и мальтотриозу [2]. Пристальное внимание заслу-
живает исследование водного обмена в дрожжевых клетках, поскольку вода служит растворителем для органических молекул и солей. Прямым методом исследования проницаемости воды является метод ЯМР с импульсным градиентом магнитного поля [3]. Этот метод был успешно применен для определения размеров биологических клеток и их проницаемости [4—7]. Цель настоящей работы — исследование проницаемости воды в клетках дрожжей Saccharomyces cerevisiae рас Y-3137 и Y-3327 методом ЯМР с импульсным градиентом магнитного поля (ЯМР ИГМП) в зависимости от времени культивирования.
Исследуемые расы дрожжей, селекционированные во ВНИИ пищевой биотехнологии, различаются по физиолого-морфологическим свойствам. Дрожжи Saccharomyces cerevisiae Y-3137 обладают осмофильными и термотолерантными свойствами и способны сбраживать зерновое сусло с концентрацией (растворимых сухих веществ) РСВ до 26% при повышенных температурах (35— 37°С) [8].
Раса спиртовых дрожжей Saccharomyces cerevisiae Y-3327 является осмофильной и выдерживает высокое осмотическое давление зернового сусла с концентрацией (РСВ) до 36%, обладает направ-
ВОДНЫЙ ОБМЕН В КЛЕТКАХ ДРОЖЖЕЙ SACCHAROMYCES CEREVISIAE РАС У-3137
709
90° 90° 90°
Рис. 1. Импульсная последовательность стимулированного эха: б — длительность импульсного градиента магнитного поля, go — амплитуда постоянного градиента магнитного поля, § — амплитуда импульсного градиента магнитного поля, т и Т1 — расстояния между радиочастотными импульсами, Д — расстояние между импульсами градиента магнитного поля.
ленной биосинтетической способностью по отношению к этанолу, устойчива к повышенным концентрациям спирта до 17—18% об., оптимальная температура культивирования 30—32°С [9, 10].
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Образцы спиртовых дрожжей были предоставлены ГНУ ВНИИ пищевой биотехнологии. Первый образец раса У-3137. Родословная штамма: семейство 8аееИагошуее1аееа, род 8аееИагошуее8 Меуп, вид 8аееИагошуее8 ееге^ае. Штамм получен селекционным путем. Клетки дрожжей расы У-3137 крупные, округлые, яйцевидной формы, реже овальной, удлиненной. Средний размер клеток 7.0—10.0 х 5.0—7.5 мкм. Дрожжи выращивали на солодовом сусле с концентрацией сухих веществ 15% при температуре 35°С, время выращивания составляло 24 и 48 ч.
Второй образец раса У-3327. Родословная штамма: семейство 8аееИагошуее1аееа, род 8ае-еИагошуее8 Меуп, вид 8аееИагошуее8 ееге^ае. Штамм получен методом селекции и мутагенеза. Клетки дрожжей расы У-3327 округлые, реже овальной формы. Средний размер клеток 2 х 2— 6 х 6 мкм. Дрожжи выращивали на солодовом сусле с концентрацией сухих веществ 15% при температуре 30°С, время выращивания составляло 24 и 48 ч.
Клетки дрожжей промывали водопроводной водой и центрифугировали. Данную операцию повторяли 3 раза с целью отмывки клеток от питательной среды. Полученные образцы переносили в стандартные 5 миллиметровые ампулы, которые помещали в ЯМР-спектрометр.
Коэффициенты самодиффузии воды (КСД) измеряли методом ЯМР ИГМП на ядрах 1Н на спектрометре Вгикег Ауапее-Ш — 400 с блоком импульсного градиента ёШШ 60, позволяющим получать градиенты с максимальной амплитудой до
30 Тл/м. Использовали импульсную последовательность "стимулированного эха", представленную на рис. 1 [3, 4, 7].
В ходе экспериментов регистрировали уменьшение сигнала спинового эха с увеличением амплитуды импульса градиента магнитного поля при постоянных временах задержки между радиочастотными импульсами и постоянной длительности градиентного импульса. Сигнал спинового эха подвергали преобразованию Фурье. Для расчетов использовали интегральные интенсивности линии воды в спектрах эха. Для исследования ограниченной диффузии получали зависимости коэффициентов самодиффузии от времени диффузии Длительность градиентного импульса б составляла 1 мс. Время диффузии ^ = Д — б/3 варьировалось от 20 до 1000 мс. Число точек в диффузионном затухании составляло 64. Период повторения последовательности был равен 4 с.
ОБСУЖДЕНИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ
На рис. 2 приведены спектры протонов молекул воды, представляющие собой узкие линии с химическим сдвигом 4.7 м.д. (относительно ТМС), что соответствует химическому сдвигу объемной воды. Линии с химическими сдвигами 1 м.д. (СН3-группа) и 3.5 м.д. (СН2-группа) представляют собой продукты метаболизма дрожжевых клеток. На рис. 3 показаны диффузионные затухания протонов молекул воды, представляющие собой зависимости площадей сигналов стимулированного спинового эха от квадрата амплитуды градиентного импульса при различных временах диффузии для образцов У-3137 и У-3327. Эти зависи-
(а) 1 ..... 4 3 2 1 ррт V
(б)
11111111
11 9 7 5 3 1 -1 ррт
Рис. 2. Спектр 1Н для образцов У-3137 (а) и У-3327 (б).
мости хорошо аппроксимировались суммой трех экспонент в соответствии с уравнением
т
А(§) = x р' ехр(-у2 § 2^А;), (1)
I=1
у — гиромагнитное отношение, ^ = А — б /3 — эффективное время диффузии, § и б — амплитуда и длительность импульса градиента магнитного поля соответственно; А (Вл, Д2, В53) — коэффициенты самодиффузии, р' (р1,р2,р3) — относительные доли молекул воды в участках (заселенности фаз) при т = 3 [3, 7]. Это означает, что молекулы воды находятся в трех различных участках (фазах), в которых они имеют разные коэффициенты самодиффузии. Зависимости коэффициентов самодиффузии Б8Ъ Д2, А3 от времени диффузии ^ приведены в рис. 4. Как видно из рис. 4 коэффициент самодиффузии Д3 не зависит от времени диффузии и близок к коэффициенту самодиффузии объемной воды (2.4 х 10-9 м2/с), в то время
Размеры клеток (а) и проницаемости (Р) при разных временах выращивания клеток (т)
Т, сутки а, мкм Р X 106, м/с
У-3137
1 7.9 0.29
2 7.9 0.609
У-3327
1 5.1 0.185
2 3.84 0.526
1 5.46 1.01
2 5.18 1.35
2 5.62 0.76
как коэффициенты самодиффузии Б81 и Вб2 меньше на порядок и уменьшаются с ростом времени диффузии что указывает на ограниченный характер трансляционного перемещения молекул воды. В соответствии с [3], коэффициент характеризует внешнюю воду, в то время как коэффициенты и Вб2 относятся к внутриклеточной и межклеточной воде соответственно.
Для пористых систем с проницаемыми стенками, которые можно рассматривать как модели биологических клеток, существует возможность оценки их размеров и проницаемости. В этом случае анализируется зависимость коэффициентов самодиффузии от времени диффузии, в условиях ограниченной диффузии воды в микрообъеме мембранных систем. Идеальный вид такой зависимости представлен на рис. 5 [4, 5]. Как видно из рис. 5, при малых временах ^ (область 1), молекулы воды, не успевая достигать стенок пор, не испытывают ограничений и коэффициент самодиффузии А = А0 не зависит от td. При больших временах диффузии молекулы воды в результате эффекта проницаемости, успевают продиффун-дировать в соседние поры, и измеряемый коэффициент диффузии Бр также не зависит от ^ (область 3).
Для полностью ограниченной диффузии характерна зависимость КСД от времени диффузии
А ~ Получаемое отклонение от зависимости может быть объяснено наличием проницаемости клеток [3]. В этом случае для определения проницаемости мембранных клеток и их размеров воспользуемся скейлинговым подходом, в котором рассчитывается эффективный коэффициент самодиффузии, удовлетворяющий условию
пропорционально ^1 [3, 7].
Ае%) = [А- А]А)/[А - А&)]. (2)
Из уравнения (2), приняв А0 = 1.3 х 10-9 м2/с (коэффициент самодиффузии внешней воды), определяем эффективные коэффициенты самод
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.