ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2015, том 62, № 5, с. 720-728
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 581.1
ВОССТАНОВЛЕНИЕ ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКИХ И ФИЗИОЛОГИЧЕСКИХ ХАРАКТЕРИСТИК ПОПУЛЯЦИИ КЛЕТОК ЛЮЦЕРНЫ ПОСЛЕ
КРИОГЕННОГО ХРАНЕНИЯ © 2015 г. Л. А. Волкова, В. В. Урманцева, А. Б. Бургутин, А. М. Носов
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН, Москва Поступила в редакцию 11.11.2014 г.
После 27 лет хранения в жидком азоте был возобновлен рост суспензионной культуры клеток люцерны (Medicago sativa L.). Исследовано действие факторов, влияющих на уровень жизнеспособности клеток люцерны in vitro, а также их цитогенетические и физиологические характеристики после хранения при температуре жидкого азота (—196°С). В результате процедуры замораживания-оттаивания погибало около 80% преимущественно полиплоидных клеток, при этом основным повреждающим фактором являлся осмотический стресс. Таким образом, после криогенного хранения культура клеток была представлена преимущественно окологаплоидными и околодиплоидными клетками. Через 35 циклов роста в возобновленной популяции установилось динамическое равновесие клеток разных уровней плоидности с модальным классом (более 50%) полиплоидных клеток. Особенностью исследуемого штамма является высокая активность пероксидазы (ПО). После криогенного хранения отмечено существенное снижение активности ПО, однако в течение 35 циклов выращивания происходило постепенное увеличение активности фермента до уровня, характерного для исходной (до замораживания) культуры клеток. Для защиты клеток от эндогенного льдообразования использовали криопротектор диметилсульфоксид (ДМСО). Установлено, что ДМСО в концентрации 7% был мало эффективен для защиты клеток от осмотического стресса, не обладал значительным антирадикальным действием по отношению к супероксид-аниону, но оказывал влияние на жизнеспособность возобновленных клеток, активность ПО и альдегидредуктазы и уровень пере-кисного окисления липидов.
Ключевые слова: Medicago sativa — культура клеток — криогенное хранение — диметилсульфоксид — пло-идность — пероксидаза — альдегидредуктаза
DOI: 10.7868/S001533031504017X
ВВЕДЕНИЕ
Культура клеток растений представляет собой уникальную биологическую систему, которая может быть использована в качестве удобной модели для изучения физиологических и биохимических процессов, протекающих в растительном организме [1]. Для подобных исследований необходимы хорошо охарактеризованные "модельные" культуры клеток, что в свою очередь требует разработки надежных методов их хранения, поскольку в большинстве изученных случаев популяция клеток in vitro характеризуется высоким уровнем измен-
Сокращения: ДМСО — диметилсульфоксид; ТБК-АП — комплекс тиобарбитуровой кислоты и взаимодействующих с ней активных продуктов; АРД — альдегидредуктаза; ПО — пероксидаза.
Адрес для корреспонденции: Волкова Людмила Александровна. 127276 Москва, Ботаническая ул., 35. Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН. Электронная почта: la-volkova@yandex.ru
чивости, в том числе различных перестроек генома, включая изменения числа хромосом, что отражается на свойствах популяции [2, 3]. Например, увеличение частоты появления полиплоидных клеток часто связывают со снижением их тотипо-тентности [4], что ограничивает возможности клеточной селекции по получению форм, устойчивых к стрессам. Изменение профиля плоидности популяции клеток может приводить как к повышению [5], так и к понижению [6] содержания вторичных метаболитов.
Криосохранение — один из наиболее перспективных способов сохранения генофонда высших растений и животных. Во многих работах показано сохранение генетической стабильности, способности клеток к делению и регенерации растений [7, 8], а также продуктивности синтеза вторичных метаболитов [9, 10]. Тем не менее, имеются работы, позволяющие говорить о возможности появления модификаций генома в ходе
процедуры криогенного хранения, в частности, выявлены изменения последовательностей ДНК образцов каллусов яровой пшеницы [11]. Успех низкотемпературного криоконсервирования зависит от целого ряда факторов: генетических и морфологических особенностей клеток, состава среды консервирования, вида и концентрации криопротектора, режима охлаждения и условий оттаивания, способности к закаливанию и уровня проницаемости криопротектора [12]. В качестве последнего наиболее часто используют диметил-сульфоксид (ДМСО) — или один, или в смесях с добавлением сахарозы или глицерина [13]. Наряду с криозащитными свойствами ДМСО в концентрации свыше 10% обладает токсическим действием по отношению к замораживаемым биообъектам. Кроме того, согласно результатам работ [13, 14], были зарегистрированы изменения в последовательностях ДНК после обработки эмбриогенной культуры пихты ДМСО, а также после обработки апексов Carica papaya витрифицирующим раствором PVS 2, содержащим 15% ДМСО.
Используемый в настоящей работе штамм суспензионной культуры люцерны характеризовался высокой конститутивной активностью гваякол-зависимой пероксидазы (ПО), а также потенциальной активностью альтернативной ПО в митохондриях [15, 16]. Чтобы сохранить уникальный штамм, 27 лет назад клетки суспензионной культуры люцерны были помещены на хранение в жидкий азот при температуре —196° С (криохра-нилище ИФР РАН).
Механизм возобновления растительных клеток после криогенного хранения исследован недостаточно. Основные трудности связаны со спецификой как самих растительных клеток, так и их популяций. Клетки в таких популяциях генетически гетерогенны и асинхронны, имеют физиологические и морфологические вариации, поэтому далеко не все клетки выдерживают процедуру замораживания—оттаивания и сохраняют способность к дальнейшему возобновлению [17].
В связи с этим целью настоящего исследования явилось изучение факторов, влияющих на уровень жизнеспособности и состав популяции клеток люцерны после криогенного хранения.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Объектом исследования служила культура клеток люцерны (Medicago sativa L.), полученная из листьев зеленых проростков на среде Гамборга в 1984 г [15]. В виде суспензионной культуры клетки люцерны выращивали на среде МС с 3% сахарозой и регуляторами роста: 0.1 мг/л кинетина и 1 мг/л 2,4-Д. В 1986 г. клетки суспензионной культуры на 8-10-й день цикла роста были подвергнуты глубокому замораживанию до —196°С по ме-
тоду, описанному в работе [10]. Защита клеток осуществлялась с помощью 7% ДМСО. Через 27 лет клетки были разморожены в водяной бане при 40° С, отмыты питательной средой от ДМСО и помещены в жидкую среду для последующего выращивания.
Состав популяции клеток определяли по уровню плоидности. Для этого после фиксации клеток в течение суток в ацеталкоголе (1 : 3) готовили давленые ацетоорсеиновые препараты по методике [18]. Фиксированные клетки анализировали по числу хромосом в метафазе. Точность подсчета хромосом зависела от их числа. Метафазы с числом хромосом до 2п подсчитаны с точностью до одной хромосомы, от 3п до 4п и более — с точностью до 3—4 хромосом. По этой причине полученный в исследовании ряд хромосомных чисел разбивали на классы (клетки окологаплоидные, околодиплоидные, околотриплоидные и т.д.). Число хромосом было подсчитано в 150 метафазах на 3 препаратах.
Содержание вторичных продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ) оценивали по ТБК-те-сту с образованием окрашенных комплексов тио-барбитуровой кислоты при высокой температуре в кислой среде. Содержание ТБК-активных продуктов рассчитывали с использованием коэффициента экстинкции малонового диальдегида, равного 155/(ммоль см) и выражали в мкмоль/г сырой массы [19].
Определение антирадикальных свойств ДМСО в бесклеточной системе. Антирадикальную активность ДМСО по отношению к анион-радикалу кислорода изучали в реакционной среде (без гомо-гената клеток), содержавшей метионин, рибофлавин и нитросиний тетразолий. Раствор ДМСО в концентрациях 1—20% добавляли к среде, где определяли содержание формазана по методу [20]. Антирадикальную активность выражали в % образовавшегося формазана по сравнению с его уровнем в реакционной среде.
Определение активности ферментов. После гомогенизации клеток (100—200 мг) в 0.05 М калий-фосфатном буфере с рН 5.5 для ПО и 6.9 для НАД-Н-альдегидредуктазы (АРД), гомогенат центрифугировали при 10000 g в течение 10 мин. Полученный супернатант использовали для определения активности ферментов.
Активность растворимой ПО (КФ 1.1.11.7) определяли по начальной скорости окисления гваякола перекисью водорода по методу [21]. Окисление гваякола регистрировали по увеличению поглощения при 470 нм (е = 26.6/(моль см)). За единицу активности фермента принимали количество гваякола (ммоль), окисленного за 1 мин на 1 г сухой биомассы.
Снижение активности гваякол-зависимой ПО определяли по методу, описанному в работе [22],
о 8 С 8
й S н
О зК g Q
<ч
^4500 | 4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 0
£
10 27
Цикл роста
Рис. 1. Активность пероксидазы в разных циклах роста.
и вычисляли по формуле: % снижения = 100 (1 — — А1/А2), где А1 — активность фермента (мкмоль/(г сухой массы мин)) после внесения НАД • Н, А2 — активность фермента без НАД • Н.
Активность Н АД ■ Н -альдегидредуктазы (АРД, КФ 1.1.1.1.) оценивали по скорости окисления НАД • Н при восстановлении пропионового альдегида (s = 6.22/(мкмоль см)) по методу, описанному в работе [23], и рассчитывали в мкмоль НАД • Н/(г сухой массы мин).
Жизнеспособность клеток оценивали микроскопически после реакции с 0.1% феносафрани-ном, который окрашивает только клетки с нарушенной избирательной проницаемостью мембран [24]. При микроскопировании учитывали процент неокрашенных (живых) клеток не менее, чем в 200 клеточных агрегатах.
Осмотическое воздействие осуществляли посредством добавления маннита с постепенно увеличивающейся концентрацией до 20%; клетки выдерживали в растворе маннита в течение 1 ч. После ступенчатого деплазмолиза определяли жизнеспособность клеток. Клетки отмывали от осмотика питательной средой путем отстаивания. При совместном действии с ДМСО клетки вначале выде
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.