НЕЙРОХИМИЯ, 2010, том 27, № 3, с. 221-229
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ РАБОТЫ
УДК 612.822.1-577.152.1
ВОЗДЕЙСТВИЕ МЕЛАТОНИНА И ПЕПТИДОВ ЭПИФИЗА НА КАТЕХОЛАМИНЕРГИЧЕСКОЕ ЗВЕНО ГИПОТАЛАМИЧЕСКОЙ РЕГУЛЯЦИИ РЕПРОДУКТИВНОЙ ФУНКЦИИ КРЫС
© 2010 г. Ю. П. Милютина, А. В. Кореневский, М. Г. Степанов, А. В. Арутюнян*
НИИ акушерства и гинекологии им. Д.О. Отта СЗО РАМН, Санкт-Петербург
Работа посвящена исследованию корригирующего влияния мелатонина и пептидов эпифиза (эпита-ламина и эпиталона) на суточную динамику содержания норадреналина (НА) в медиальной преопти-ческой области (МПО) и дофамина (ДА) в срединном возвышении с аркуатными ядрами (СВ-Арк), нарушенную однократным введением 1,2-диметилгидразина (ДМГ). Установлено, что введение гормона эпифиза мелатонина способно устранять ряд нарушений гипоталамического звена репродуктивной системы, наблюдаемых при воздействии нейротоксического ксенобиотика ДМГ. Изучение эффекта эпиталамина на циркадианные ритмы, нарушенные под воздействием нейротоксического соединения ДМГ, показало восстановление характера суточной динамики НА в МПО. При этом наблюдалось снижение уровня норадреналина от 9:30 к 11 часам циркадианного времени, характерное для контрольных животных. Эпиталон оказался более эффективным на уровне СВ-Арк, он предотвращал нарушение суточного ритма ДА, вызванное воздействием ксенобиотика, сохраняя низкий уровень этого моноамина в 5 часов циркадианного времени, с повышением его к 11 часам. Полученные результаты свидетельствуют о важной роли эпифиза в формировании циркадианного сигнала, необходимого для появления пика гонадолиберина в день проэструса.
Ключевые слова: гипоталамус, циркадианные ритмы, норадреналин, дофамин, 1,2-диметилгидразин, мелатонин, эпиталамин, эпиталон.
ВВЕДЕНИЕ
Процессу овуляции, с которого начинается отсчет каждого репродуктивного цикла, предшествуют гормональные изменения в организме, среди которых важнейшим является резкое повышение в крови уровня гонадотропных гормонов гипофиза, вызванное гиперсекрецией гонадолиберина. Для осуществления преовуляторного пика секреции го-надолиберина, кроме повышения уровня в крови синтезируемых яичниками половых стероидов, необходим циркадианный сигнал, ежедневно поступающий из супрахиазматических ядер (СХЯ) гипоталамуса к нейрональным структурам, ответственным за синтез (медиальная преоптичекая область — МПО) и секрецию (срединное возвышение с аркуатными ядрами — СВ-Арк) этого нейрогормона [1, 2, 3, 4]. Оба эти сигнала передаются к гонадоли-беринэргическим нейронам опосредовано через нейромедиаторные системы. Было показано, что возрастные изменения преовуляторного пика секреции гонадолиберина и гонадотропинов связаны со снижением активности нейромедиаторных систем, контролирующих эти процессы, в частности, ослаблением сигнала, поступающего от СХЯ [5].
* Адресат для корреспонденции: 199034 С.-Петербург, Менделеевская линия, 3; тел.: (812) 328-98-91, факс: (812) 32823-61; e-mail: arutjunyan@aa3703.spb.edu
Исчезновение суточных ритмов активности моно-аминэргических и опиодных систем в МПО и СВ-Арк гипоталамуса, и как следствие, секреции гона-долиберина, наблюдающееся в процессе старения, или в результате воздействия ксенобиотиков является наиболее ранними признаком нарушения эст-ральных циклов самок крыс [6, 7]. В исследованиях, проведенных нами ранее, было обнаружено изменение суточной динамики норадреналина в МПО, со снижением его содержания в узкий интервал времени от 9.5 до 11 часов циркадианного времени (ЦВ) и дофамина в СВ-Арк, с повышением уровня этого нейромедиатора в интервале от 5 к 9.5 часам ЦВ. Эти сдвиги носят циркадианный характер, то есть не зависят от уровня половых стероидов в крови и сохраняются в условиях постоянной темноты и, вероятно, опосредуют регуляцию синтеза и секреции гонадолиберина со стороны циркадианного осциллятора [8, 9].
Циркадианный осциллятор в СХЯ может вызывать индукцию суточных ритмов организма не только через нейрональные пути, но также через регуляцию суточных ритмов гормонов. Большое внимание в последние годы привлечено к изучению воздействия эпифизарного гормона мелатонина на гипоталамо-гипофизарное звено регуляции репродуктивной функции [8, 10, 11, 12, 13]. Известно, что эпифиз, наряду с корой головного мозга, гипотала-
мусом, гипофизом, яичниками, является одной из основных структур, участвующих в осуществлении механизмов нейрогуморальной регуляции функции репродуктивной системы [14]. Кроме того, наиболее важными физиологическими эффектами мела-тонина являются контроль циркадианных и сезонных ритмов, а также стимуляция многих метаболических процессов. Как сильный эндогенный антиоксидант, он играет важную роль в защите нейронов от окислительного стресса [15, 16]. Однако, по некоторым данным, экзогенно введенный мела-тонин способен вызывать ряд побочных эффектов у экспериментальных животных [17].
Таким образом, актуальным представляется поиск соединений, способных предотвратить нарушение процессов передачи информации о суточном периодизме от супрахиазматических ядер (СХЯ) гипоталамуса к нейромедиаторным системам МПО и СВ-Арк, участвующим в регуляции репродуктивной функции. С этой целью нами была предпринята попытка использовать гормон эпифиза мелато-нин, а также, соединения, которые, по многочисленным данным [18, 19], способны стимулировать синтез и/или синхронизировать секрецию эндогенного мелатонина — полипептидный препарат эпифиза эпиталамин и синтетический тетрапептид эпиталон (Ala—Glu—Asp—Gly).
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Эксперименты были выполнены на 300 половозрелых крысах-самках линии Вистар массой 200— 250 г. Животные содержались в виварии с искусственной вентиляцией и контролируемым световым режимом (день 8.00—20.00, ночь 20.00—8.00), получали стандартную пищу и воду. Животные были разделены на 6 групп. Первая группа (контрольная): животные, которым вводился физиологический раствор в течение 4 дней.
Вторая группа: животные, которые подверглись однократному введению 1,2-диметилгидра-зина гидрохлорида (Sigma). Ксенобиотик, растворенный ex tempore в 0.9% растворе натрия хлорида, вводили в дозе 19.2 мг/кг массы (в расчете на основание), как описано ниже.
Третья группа: животные, получавшие инъекции мелатонина, вечером, в течение четырех дней (один эстральный цикл, начиная со стадии проэструса).
Четвертая группа: животные, которым на фоне 4-дневного введения мелатонина была сделана инъекция ДМГ.
Пятая группа: животные, которым инъекция ДМГ была сделана на фоне 4-дневного введения эпиталамина.
Шестая группа: животные, которым на фоне 4-дневного введения эпиталона была сделана инъекция ДМГ.
ДМГ вводили утром накануне дня проэструса в 3 часа циркадианного времени. Мелатонин, эпита-ламин и эпиталон — в 10 часов циркадианного времени в дозе 1 мг/кг, 1 мг/кг и 2 мкг/кг массы тела соответственно. Все препараты вводили внутрибрю-шинно, в объеме 250 мкл. Декапитацию животных производили в 5, 9:30 и 11 ч. циркадианного времени (ЦВ).
Стадии эстрального цикла определяли по влагалищным мазкам. Правильность отбора подтверждали post mortem, измеряя массу яичников и оценивая состояние матки. Из мозга декапитирован-ных животных под лупой выделяли МПО, срединное возвышение с аркуатными ядрами и прилежащими гипоталамическими структурами, так называемый медиовентральный гипоталамус (СВ-Арк), замораживали в жидком азоте и хранили при —70°С до начала анализа.
После размораживания исследуемые структуры мозга гомогенизировали в 0.25 мл 0.1 М хлорной кислоты, содержащей 0.05% метабисульфита калия, центрифугировали (10000 g, 15 мин., +4°С), осадок отбрасывали, а супернатант переносили в прибор для микрофильтрации и фильтровали через капроновый фильтр с диаметром пор 0.2 мкм; фильтрат подвергали хроматографическому анализу в тот же день.
Количественный анализ НА и ДА в исследуемых областях гипоталамуса проводили методом ВЭЖХ с электрохимическим детектированием [6]. Хромато-графическое разделение биогенных аминов осуществляли на колонке Reprosil 80 ODS-2 (100 х х 4 мм, 3 мкм, Dr. Maisch GmbH, Германия). Детектирование проводили на аналитической ячейке модели 5100А Coulochem II (ESA, США) при потенциале +0.65 В. Подвижная фаза содержала 6 мМ цитратного буфера, 2 мМ этилендиаминтетрааце-тата натрия, 1.1 мМ октилсульфоната натрия и 7% ацетонитрила (v/v). Расход элюента — 0.75 мл/мин. Содержание определяемых веществ рассчитывали в нанограммах на миллиграмм белка, который определяли по методу \fera [20].
Статистическую обработку данных выполняли с использованием дисперсионного анализа и t-кри-терия Стьюдента. Достоверность суточных ритмов оценивали при помощи однофакторного дисперсионного анализа.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
В исследованных областях гипоталамуса, в норме было подтверждено наличие суточных ритмов содержания различных биогенных аминов. Ранее, в наших работах было показано, что НА осуществляет регуляцию синтеза гонадотропин-рилизинг-гор-мона (гонадолиберина, ГнРГ) в МПО со стороны циркадианного осциллятора. В СВ-Арк процесс выброса ГнРГ, вероятно, связан с суточной динами-
кой ДА. Сдвиги в содержании этих нейромедиато-ров наблюдались во второй половине дня проэстру-са, т.е. в то время, когда наблюдается пик ГнРГ, однако, их суточная динамика не зависит от уровня половых стероидов в крови. Изменение активности этих нейромедиаторных систем может являться механизмом, благодаря которому формируется "интервал чувствительности" гонадолиберинергиче-ских нейронов к стимулирующему сигналу, поступающему от СХЯ. Содержание НА в СВ-Арк и ДА в МПО, по данным предыдущих исследований, имело иную зависимость и определялось стадией эст-рального цикла экспериментальных животных [9]. В данном исследовании мы ограничились рассмотрением только циркадианного контроля регуляции репродуктивной функции. Так в МПО, уровень НА претерпевал суточные изменения, с отмеченным нами в предыдущих исследованиях подъемом содержания этого нейромедиатора в дневное время (24.29 ± 1.53 нг/мг белка), по сравнению с его утренним значением (20.41 ± 1.42 нг/мг белка), и снижением его в вечерние часы (20.85 ± 0.87 нг/мг белк
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.