ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2007, том 54, № 3, с. 469-474
УДК 581.1
ВОЗДЕЙСТВИЕ Pb2+ НА АКТИВНОСТЬ АНТИОКСИДАНТНЫХ ФЕРМЕНТОВ И УЛЬТРАСТРУКТУРУ КЛЕТОК ЛИСТЬЕВ Potamogeton crispus
© 2007 г. Ц. Ц. Ху, Г. С. Ши, Ц. С. Су, С. Ван, Ц. X. Юан, К. X. Ду
Институт клеточной и молекулярной биологии растений, Педагогический университет Нанкина, Нанкин, Китай Поступила в редакцию 12.01.2006 г.
Изучали воздействие различных концентраций Pb2+ на активность антиоксидантных ферментов и ультраструктуру клеток листьев Potamogeton crispus L. При добавлении Pb2+ возрастала активность пероксидазы и увеличивалось содержание малонового диальдегида, однако затем при увеличении концентрации Pb2+ наблюдали снижение данных показателей. В то же время активность суперок-сиддисмутазы и каталазы сначала снижалась, а впоследствии возрастала. Одновременно при увеличении концентрации Pb2+ снижалось содержание хлорофилла. Высокие концентрации Pb2+ вызывали повреждение ультраструктуры клеток листьев, в том числе набухание хлоропластов, повреждение и исчезновение оболочки хлоропластов, набухание митохондриальных крист, деформацию и вакуолизацию митохондрий, конденсацию хроматина, исчезновение ядрышка, повреждение ядерной оболочки. Изменение активности антиоксидантных ферментов и повреждение ультраструктуры клеток является результатом накопления перекисных радикалов, индуцированного свинцом. Его летальная концентрация для P. crispus находится в диапазоне от 10 до 15 мг/л.
Potamogeton crispus - ион свинца - антиоксидантные ферменты - повреждение ультраструктуры -токсичность
ВВЕДЕНИЕ
Загрязнение почвы, воды и воздуха тяжелыми металлами вследствие быстрой индустриализации и урбанизации представляет большую опасность для биосферы. Свинец - широко распространенный во внешней среде и опасный элемент. Его основными источниками являются угольная промышленность, соединения свинца, входящие в состав бензина, сточные воды и промышленные выбросы, обогащенные свинцом, а также краски, содержащие свинец [1]. Свинец может причинять вред растениям при контактном воздействии. Избыток свинца является токсичным и вызывает такие симптомы, как отставание в росте, деградация пигментов фотосинтеза, перекисное окисление липидов и т.д. вследствие вмешательства во многие метаболические процессы [2, 3]. Такие ответные реакции могут быть биоиндикаторами загрязнения среды металлами.
Сокращения: СОД - супероксиддисмутаза; МДА - малоновый диальдегид; R - коэффициент корреляции; sd - стандартное отклонение.
Адрес для корреспонденции: Dr. X. Wang, Institute of Plant Cell and Molecular Biology, College of Life Science, Nanjing Normal University, Nanjing 210097, China. Fax: +86-25-8359-8257; e-mail: gxshi@njnu.edu.cn
Potamogeton crispus Ь. (Potamogetonaceae) - подводное растение, отличающееся быстрым ростом и высокой продуктивностью биомассы [4] и способностью очень хорошо расти в загрязненных (в том числе свинцом) водоемах [5]. Поэтому физиологические и ультраструктурные изменения в Р. crispus, вызванные РЬ2+, могут отражать уровень загрязнения свинцом воды в водоеме. Главной целью настоящего исследования являлось изучение влияния ионов свинца на ряд физиологических параметров в растениях Р. crispus, изменения ультраструктуры клеток листьев под влиянием ионов Рь, а также изучение возможных стратегий адаптации Р. crispus к условиям РЬ-стресса.
МЕТОДИКА
Растительный материал и условия выращивания. Растения Potamogeton crispus Ь. собирали в незагрязненных водоемах и давали им адаптироваться более шести месяцев, выращивая в широких стеклянных трубках в естественных условиях (корни растения в донных отложениях, нормальные фотопериод, температура и т.д.). Впоследствии растущие побеги таких растений отрезали от материнского растения, промывали три раза под струей водопроводной воды и выращивали в 5%-ном питательном растворе Хогланда в тече-
Воздействие Pb2+ на активность антиоксидантных ферментов в листьях P. crispus
Концентрация свинца, мг/л Активность СОД, ед./г сырого веса Активность каталазы, ед./г сырого веса Активность пероксидазы, А470/(мин г сырого веса)
0 1709.0 ± 2.5 101.8 ± 1.3 187.9 ± 0.8
5 1279.5 ± 3.2 89.2 ± 1.2 298.9 ± 1.3
10 925.2 ± 1.9 54.1 ± 1.3 485.3 ± 2.1
15 877.2 ± 1.7 37.4 ± 0.3 609.7 ± 1.3
20 606.1 ± 1.6 67.5 ± 1.7 691.9 ± 1.6
50 1268.4 ± 2.9 111.4 ± 1.4 556.2 ± 1.4
Примечание. A470 - поглощение при 470 нм.
ние двух недель при освещенности 114 мкмоль/(м2 с) с фотопериодом 14 ч и при температуре 25/20°C (день/ночь). Эти растения затем разделяли на шесть групп и обрабатывали раствором Pb(NO3)2 в различных концентрациях (0, 5, 10, 15, 20 и 50 мг/л) при вышеупомянутых условиях. Каждый день регистрировали рост растений. Через три дня собирали листья, с третьего по восьмой от апекса контрольных и опытных растений.
Измерение физиологических параметров. Навеску листьев (1 г свежих листьев) гомогенизировали в 4 мл выдержанного на льду 50 мМ фосфатного буфера (pH 7.8), содержащего 1% поливинилполи-пирролидона. Гомогенат центрифугировали при 10 000 g в течение 20 мин, и супернатант использовали для оценки активности ферментов. Активность супероксиддисмутазы (СОД) измеряли в соответствии с Qyanagui и сотр. [6]. За одну единицу активности принимали количество фермента, с помощью которого в реакционной смеси ингиби-ровалось 50% активности супероксидного анион-радикала. Активность пероксидазы измеряли по окислению гваякола, которое регистрировали по поглощению при 470 нм [7]. Активность катала-зы оценивали согласно методике, прилагаемой к набору реагентов CAT, купленных в Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute (Китай).
Перекисное окисление липидов в тканях растений измеряли по содержанию малонового ди-альдегида (МДА), как описано Heath и Packer [8]. Свежие листья (500 мг) обрабатывали 4 мл 20%-ной ТХУ, и гомогенат центрифугировали при 10000 g в течение 15 мин. Реакционную смесь, содержавшую 1.5 мл супернатанта и 2.5 мл 0.5%-ной тиобарбитуровой кислоты в 20%-ной ТХУ, инкубировали при 100°C в течение 30 мин, быстро замораживали во льду и центрифугировали при 10000 g в течение 15 мин. Концентрацию МДА измеряли при 532 нм с помощью спектрофотометра 754 ("Shanghai Precision Sci. Instr.", Китай). Коэффициент молярной экстинкции МДА,
применяемый в расчетах, был равен 155/(мМ см). Неспецифическую экстинкцию при 600 нм вычитали. Хлорофилл экстрагировали охлажденным 80%-ным ацетоном (по объему) и его содержание оценивали по методике Хи и др. на спектрофотометре 754 [9].
Эксперименты повторяли, по крайней мере, дважды. Вес всегда определяли у свежих листьев. Средние величины и их стандартные отклонения представлены в таблице и на рисунках. Корреляцию между концентрацией РЬ2+ и каждым параметром описывали с помощью коэффициента корреляции (Я).
Наблюдение ультраструктуры клеток листьев
растений. Третий лист от верхушки растений (контрольных и опытных) дважды фиксировали (в 2.5%-ном глутаровом альдегиде и 2%-ной осмиевой кислоте), дегидратировали в серии растворов этанола и препарат заливали в Ероп812. Ультратонкие срезы толщиной 70 нм, сделанные алмазным ножом ('ЪКВ", Швеция), окрашивали сначала уранилацетатом, а затем цитратом свинца, после чего наблюдали и фотографировали с помощью электронного микроскопа Н^сЫ600-А-2 (Япония).
РЕЗУЛЬТАТЫ
Влияние РЬ2+ на рост Р. crispus
Растения Р. crispus при обычных условиях росли хорошо, их побеги выглядели свежими и ярко-зелеными. После обработки растений РЬ2+ в концентрации 15 мг/л в течение четырех дней зрелые листья, находящиеся далеко от верхушки, слегка утрачивали зеленую окраску. Эти симптомы были более выражены после обработки растений РЬ2+ в концентрации 50 мг/л. Более длительное воздействие и более высокие концентрации РЬ2+ усиливали его токсичность. Через семь дней все растения Р. crispus, кроме контрольных, погибали.
Таким образом, влияние РЬ2+ на развитие симптомов токсичности у растений является дозозави-симым. Растения, обработанные РЬ2+ в концентрации 10 мг/л в течение 7 дней, могли нормально расти после их переноса обратно на раствор Хогланда без РЬ. Однако растения, обработанные РЬ2+ в концентрациях выше 15 мг/мл, постепенно погибали.
Влияние РЬ2+ на активность антиоксидантных ферментов
Активность как СОД, так и каталазы уменьшалась при возрастании концентрации свинца, особенно после обработки РЬ2+ в концентрациях 20 и 15 мг/л (таблица). Установлена отрицательная корреляция между активностью этих ферментов и концентрацией РЬ2+ (Ясод = -0.969; Якат = -0.984). Активность пероксидазы возраста-
ВОЗДЕЙСТВИЕ РЬ2+ НА АКТИВНОСТЬ АНТИОКСИДАНТНЫХ ФЕРМЕНТОВ 471
0 5 10 15 20 50 Концентрация свинца, мг/л
Рис. 1. Влияние РЬ2+ в различных концентрациях на содержание хлорофилла.
0 5 10 15 20 50 Концентрация свинца, мг/л
Рис. 2. Влияние РЬ содержание МДА.
2+
различных концентрациях на
ла с увеличением концентрации РЬ2+ и была наибольшей при обработке растений РЬ2+ в концентрации 20 мг/л (Яперокс = 0.992) (таблица).
Повреждение клеток под действием РЬ2+
В отличие от листьев контрольных растений, в листьях опытных растений с увеличением концентрации РЬ2+ содержание хлорофилла постепенно снижалось (Я = -0.897) (рис. 1). Содержание МДА было наибольшим, значительно превышающим его уровень в контрольных растениях после обработки растений РЬ2+ в концентрации 20 мг/л и снижалось при концентрации РЬ2+ 50 мг/л (Я = 0.998) (рис. 2).
Влияние РЬ2+ на ультраструктуру клеток листьев растений
В естественных условиях цитоархитектура клеток листьев Р. crispus была обычной, в клетках присутствовали различные органеллы (рис. 3а-3в). В клетках контрольных листьев содержалось много вытянутых и округлых хлоропластов. Слои гран были упорядочены (рис. 3а). Кристы митохондрий были распределены равномерно, внутриклеточный матрикс был плотным и толстым (рис. 36). Ядро имело отчетливую двуслойную оболочку и интактный хроматин (рис. 36). Однако после обработки растений РЬ2+ в концентрации 5 мг/л в течение трех дней наблюдали небольшое набухание хлоропластов. Изменения были более заметны при концентрации РЬ2+ 10 мг/л, а именно, как правило,
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.