= ГЕНЕТИКА МИКРООРГАНИЗМОВ
УДК 633.3.31:631.461.5:579.25
ВОЗДЕЙСТВИЕ СОЛЕВОГО СТРЕССА НА ГЕНЕТИЧЕСКИ ПОЛИМОРФНУЮ СИСТЕМУ Sinorhizobium meliloti-
Medicago truncatula
© 2014 г. О. Н. Курчак, Н. А. Проворов, О. П. Онищук, Н. И. Воробьев, М. Л. Румянцева, Б. В. Симаров
Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной микробиологии Российской академии сельскохозяйственных наук, Санкт-Петербург 196608 e-mail: okurchak@yahoo.com Поступила в редакцию 07.11.2013 г.
Изучено действие солевого стресса (75 мМ NaCl) на экологическую эффективность генетически полиморфной симбиотической системы Sinorhizobium meliloti—Medicago truncatula, при котором возрастает изменчивость партнеров по симбиотическим признакам, а также интегрированность симбиоза, характеризуемая специфичностью взаимодействия партнеров (их неаддитивными генотипи-ческими вкладами в варьирование параметров симбиоза) и коррелятивными связями между этими параметрами. Установлено, что структура локуса nodD1 и состав плазмид коррелируют с эффективностью симбиоза штаммов S. meliloti с M. truncatula только в условиях стресса. Отмечено, что корреляции между симбиотической эффективностью штаммов ризобий и скоростью их роста в свобод-ноживущем состоянии проявляются в условиях стресса гораздо четче, чем без него. В стрессовых условиях эффективность симбиоза в наибольшей степени снижена у линии люцерны F83005.5, чувствительной к солевому стрессу вне симбиоза (при внесении минерального азота). Ингибирование симбиотической активности у этой линии связано с подавлением развития клубеньков, а у более устойчивых линий Jemalong 6 и DZA315.16 — с подавлением ^-фиксации. Впервые показано, что солевой стресс приводит к нарушению габитуса растений M. truncatula (отношение массы к высоте возрастает в 2—6 раз), который у солеустойчивого сорта Jemalong 6 нормализуется при инокуляции ризобиями.
DOI: 10.7868/S001667581406006X
Образование симбиозов с микроорганизмами — мощный фактор адаптации растений к неблагоприятным условиям среды, включая дефицит основных элементов питания (азота, фосфора), а также биотические (патогены, фитофаги) и абиотические (засуха, засоление) стрессы [см. обзор 1]. Преодоление этих стрессов может быть достигнуто при образовании микоризных, ризосферных и эндофитных ассоциаций, благодаря которым растения получают доступ к использованию атмосферного азота (симбиозы с эндосимбиотиче-скими или ассоциативными ^-фиксаторами) и нерастворимых почвенных фосфатов (микоризные симбиозы); оптимизируется гормональный статус растений (микробы вырабатывают ауксины или цитокинины либо блокируют синтез этилена); активируются защитные реакции растений (синтез жасмоновой кислоты или ферментов фе-нил-пропаноидного пути); образуются антибиотики или токсины [2—4].
Генетически наиболее изучены трофические симбиозы, обеспечивающие фиксацию атмосферного азота (ассоциации двудольных растений с клубеньковыми бактериями или актино-
бактериями), а также усвоение химически инертных фосфорных соединений почвы (арбускулярная микориза). При формировании ^-фиксирующего бобово-ризобиального (клубенькового) симбиоза антистрессовые эффекты обычно выражены слабо: при солевом стрессе его продуктивность снижается в связи с нарушениями развития и функционирования клубеньков [5]. Адаптация этого симбиоза к солевому стрессу может быть связана со способностью ризобий синтезировать осмопротекторы, например бетаин глицина и глутамат [6], а также с накоплением в растениях пролина и антиоксидантов [7]. Однако популяци-онно-генетические механизмы этой адаптации остаются малоизученными, что затрудняет создание стресс-устойчивых симбиозов, необходимых для возделывания бобовых растений в неблагоприятных условиях.
Ранее мы показали, что эффективность бобо-во-ризобиального симбиоза определяется специфичностью взаимодействия различных генотипов растений и бактерий, которая может быть оценена на основе их вкладов в варьирование параметров симбиоза [8, 9]; функциональной це-
3
777
лостностью симбиоза, которая может быть оценена путем факторного анализа ковариации или корреляции адаптивно значимых физиологических параметров, а также генотипических частот партнеров [10]. Кроме того, в ходе коэволюции растений и бактерий, направленной на создание эффективного и в то же время адаптированного к различным стрессам симбиоза, может возрастать уровень попу-ляционного полиморфизма партнеров.
Medicago truncatula — однолетняя люцерна, самоопылитель (способность к перекрестному опылению составляет <3% [11]), что позволяет получать потомство высокогомозиготных линий [12]. Этот вид люцерны имеет диплоидный геном и короткое время генерации, поэтому он служит удобной моделью для изучения не только роста и развития бобовых растений [13—15], но и механизмов их устойчивости к солевому стрессу [16]. Устойчивость этих растений к солевому стрессу может зависеть от типа азотного питания, а также от генотипа штамма-микросимбионта [16—18].
Цель работы — изучение связи устойчивости системы Sinorhizobium meliloti—M. truncatula к солевому стрессу с генотипической изменчивостью растительных и бактериальных партнеров по со-леустойчивости, которая определяет специфичность их взаимодействия, а также функциональную целостность и эффективность симбиоза.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Были использованы 16 различающихся по происхождению штаммов S. meliloti, выделенных из клубеньков люцерны, произрастающей в При-аральском р-не Казахстана (А9, А20, АК36, АК48, АК57, АК75, АК92, АК99, АК107), Тунисе (SII5, KIII3) [19], Кавказском регионе (Т3), Средней Азии (СА107), а также лабораторные штаммы СХМ1-105 [20], Rm2011 [21] и ABS7 [22].
Штаммы выращивали на среде TY [23] при 28°С. Солеустойчивость штаммов определяли по оптической плотности, достигаемой культурой после 9, 20 и 44 ч выращивания в пробирках с 10 мл жидкой среды TY и с добавлением NaCl в концентрации 0.7 M.
Семена однолетней люцерны M. truncatula Gaertn. линий Jemalong 6, DZA315.16 (Алжир) и F83005.5 (Франция) были получены из лаборатории Ж. Проспери (J.M. Prospéri, INRA Montpellier).
При проведении стерильных микровегетационных опытов семена люцерны M. truncatula стерилизовали концентрированной серной кислотой 5 мин, промывали стерильной водой, раскладывали в чашки Петри c водным агаром (0.7%) с добавлением 1 мкМ Gibberellin A3 (Sigma, США) и проращивали в темноте при 10°С (2 сут). Проростки переносили в стерильные пробирки с ага-ризованной минеральной средой [24] без соли
(контроль) либо с добавлением NaCl в концентрациях 15, 30, 45, 60, 75 и 90 мМ. Ингибирующий эффект соли (ИЭС) определяли по формуле ИЭС = = 1 — Мс/Мк, где Мс и Мк — массы растений при действии стресса и без него соответственно.
Для выращивания растений в режиме минерального азотного питания в среду вносили KNO3 (3 мМ), для выращивания в режиме симбиотроф-ного питания — инокулировали клубеньковыми бактериями S. meliloti. Число клубеньков и эффективность симбиоза, которую оценивали по значению относительной (в %) или абсолютной (в мг) прибавки сухой массы побегов, определяли на 56-й день вегетации (повторность опытов 10-кратная).
Для генотипирования штаммов S. meliloti изучали изменчивость структуры локуса, содержащего ген nodD1, а также состава плазмид средней молекулярной массы. Анализ состава плазмид проводили в агарозном геле по стандартной методике [25]. Рестрикционный анализ ПЦР-ампли-фицированных фрагментов гена nodD1 проводили с использованием эндонуклеазы MspI (MBI Fermentas, Литва) в 3%-ном агарозном геле [26]. Размеры фрагментов рестрикции определяли с помощью маркера молекулярной массы М100 (100—1000 пар нуклеотидов) производства Сиб-Энзим (Россия).
Для статистической обработки данных использовали стандартные процедуры дисперсионного и корреляционного анализов, t-критерий Стьюдента [27], а также методику вычисления собственных значений корреляционных матриц [28, 29], образованных из значений парных корреляций между массами корней и побегов, а также чисел клубеньков, образовавшихся при взаимодействии различных генотипов растений и бактерий. Эти значения позволяют разделять общую дисперсию изучаемых признаков на доли, которые приходятся на ортогональные векторы в многомерном биометрическом пространстве, характеризующем варьирование параметров сим-биосистемы. При ее наибольшей функциональной интегрированности одно из собственных значений матрицы отлично от нуля, а остальные равны нулю. При полном отсутствии интегриро-ванности собственные значения матрицы одинаковы. С учетом этого мы вычисляли индексы интегри-рованности симбиотической системы (ИСС) по формуле
L Z {^2 - 1
In =
L - 1
S =
z ^
m = 1
где L = 3 — число собственных значений матриц (А,! > А2 > А3), равное числу изученных признаков
L
Таблица 1. Показатели продуктивности различных линий люцерны Medicago truncatula в условиях симбиотроф-ного и минерального питания азотом при солевом стрессе (С+) или без него (С-)
Признаки Jemalong 6 DZA315.16 F83005.5
растений С- С+ С- С+ С- С+
Симбиотрофное питание азотом (инокуляция Sinorhizobium meliloti)*
Масса побегов, мг 22.9 ± 1.04 16.9 ± 1.08 27.0 ± 0.87 13.5 ± 0.71 33.4 ± 0.87 10.8 ± 1.31
Высота побегов, см 15.30 ± 0.38 5.06 ± 0.72 9.78 ± 0.31 0.81 ± 0.07 9.50 ± 0.40 0.69 ± 0.06
Габитус, мг/см 1.50 ± 0.16 2.87 ± 0.26 2.76 ± 0.27 17.61 ± 1.03 3.47 ± 0.62 15.30 ± 0.66
Прибавка массы 16.9 ± 1.04 10.9 ± 1.09 17.2 ± 0.87 3.7 ± 0.72 22.6 ± 0.93 1.3 ± 13.01
абсолютная, мг***
Прибавка массы 182.7 ± 10.2 81.7 ± 7.6 75.6 ± 6.6 37.8 ± 3.1 109.3 ± 8.8 13.7 ± 1.2
относительная, %***
Число клубеньков на 8.7 ± 0.79 7.9 ± 0.59 4.2 ± 0.17 3.7 ± 0.18 4.7 ± 0.21 1.9 ± 0.33
одно растение
Минеральное питание азотом (внесение 3 мМ KNO3) **
Масса побегов, мг 31.1 ± 1.67 27.4 ± 2.41 34.3 ± 1.14 26.2 ± 3.40 32.8 ± 1.96 14.9 ± 2.65
Высота побегов, см 11.72 ± 0.58 2.41 ± 0.42 9.29 ± 0.41 1.79 ± 0.65 9.04 ± 1.41 0.71 ± 0.39
Габитус, мг/см 2.66 ± 0.15 11.37 ± 0.99 3.69 ± 0.14 14.62 ± 1.17 3.63 ± 0.23 20.99 ± 3.54
Примечание. Жирным шрифтом выделены величины, д
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.