РАДИАЦИОННАЯ БИОЛОГИЯ. РАДИОЭКОЛОГИЯ, 2013, том 53, № 4, с. 394-400
= РАДИАЦИОННАЯ БИОХИМИЯ =
УДК 574::539.1.04:582.282.123:614.875:577.152.321
ВОЗДЕЙСТВИЕ УФ-ИЗЛУЧЕНИЯ НА ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ И ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ СВОЙСТВА СВОБОДНОЙ И ИММОБИЛИЗОВАННОЙ ГЛЮКОАМИЛАЗЫ ИЗ Aspergillis awamori © 2013 г. В. Г. Артюхов1*, Т. А. Ковалева1, Е. Л. Макарова1, О. М. Кожокина2
1Воронежский государственный университет 2Воронежская государственная медицинская академия им. Н.Н. Бурденко
Исследовано влияние УФ-света (240—390 нм) в дозах 151 — 1510 Дж/м2 на каталитическую активность свободной и иммобилизованной глюкоамилазы из Aspergillus awamori. Установлено, что потеря ферментом каталитической активности связана с фотохимическими превращениями Trp-120, входящего в состав активного центра глюкоамилазы.Показано, что использование коллагена в качестве носителя для иммобилизации глюкоамилазы приводит к уменьшению константы фотоинактивации энзима. Высказано предположение, что защитное действие коллагена по отношению к глюкоамилазе, подвергнутой УФ-облучению, может быть обусловлено как акцептированием им активных форм кислорода, так и образованием комплекса носитель—фермент, более фотоустойчивого, чем нативный энзим.
Глюкоамилаза, каталитическая активность, УФ-облучение, коллаген, иммобилизация. DOI: 10.7868/S0869803113040048
В связи с возрастающими масштабами применения иммобилизованной глюкоамилазы в хлебопечении, кондитерской, крахмалопаточной, спиртовой промышленности, в аналитических целях и медицине особую значимость приобретает исследование устойчивости иммобилизованных препаратов к действию различных физико-химических факторов, в том числе и к УФ-свету.
Изучение структуры амилолитических ферментов, расщепляющих полисахариды, способствует глубокому анализу процессов жизнедеятельности на молекулярном уровне и обусловливает практическую необходимость создания гетерогенных биокатализаторов на основе иммобилизованных ферментов промышленного назначения и медицинских препаратов пролонгированного действия. Лекарственные препараты, обладающие амилолитической активностью, широко применяются в клинической практике для лечения недостаточности желудочно-кишечного тракта различной этиологии. Создание новых фармацевтических препаратов на основе иммобилизации определяет пролонгированность их действия и снижение риска побочных эффектов.
Глюкоамилаза (К Ф 3. 2. 1. 3.) — это амилоглю-козидаза, гидролизующая связи внешних нереду-цирующих концов полисахаридных цепей, обнаружена во всех биообъектах: низших и высших
* Адресат для корреспонденции: 394006 Воронеж, Университетская пл., 1, ВГУ; тел.: (473) 220-85-86; факс: (473) 22083-08; e-mail: avg@main.vsu.ru.
растениях, в организме человека и животных, микроскопических грибах, относящихся к родам Азрв^Шш, Мисог, ЕН^орт, а также бактериях [1].
Показано, что в процессе ковал ентной и адсорбционной иммобилизации глюкоамилазы на ионитах происходит многоточечное связывание как с крахмалосвязывающим, так и с каталитическим доменами молекулы этого фермента. Кроме того, наблюдаются незначительные изменения третичной структуры, приводящие к затруднению процесса взаимодействия функциональных групп активного центра с молекулой полимерного субстрата и уменьшению каталитической активности иммобилизованного ферментного препарата.
Известно, что иммобилизация приводит к повышению стабильности энзиматических препаратов по отношению к денатурирующим факторам внешней среды по сравнению со свободными ферментами. Связывание ферментов с различными носителями повышает их устойчивость к высоким температурам, экстремальным значениям рН, ингибиторам [2—6]. Однако воздействие ультрафиолетового света на каталитическую активность и физико-химические свойства иммобилизованных ферментов изучено недостаточно.
УФ-излучение является постоянно действующим фактором внешней среды, поглощается в живых клетках в основном белками и нуклеиновыми кислотами, вызывая определенные фотохимические реакции, и оказывает мощное влияние
на многие физиологические процессы, протекающие в организме.
Изучение механизма воздействия УФ-света на белки-ферменты — одна из центральных проблем биофизики и радиобиологии, так как позволяет выявить процессы деструктивно-модифицирующего, регуляторного и лечебно-профилактического действия УФ-излучения на биосистемы различного уровня организации [7—10].
В этой связи проведено исследование воздействия УФ-излучения на процессы фотоинактивации свободной и иммобилизованной глюкоами-лазы из Aspergillus awamori.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДИКА
Объектом исследования служил коммерческий препарат глюкоамилазы из Aspergillus awamori, который подвергали очистке с помощью ионообменной и гель-хроматографии, гомогенность его подтверждали методом электрофореза в полиакриламидном геле.
Каталитическую активность глюкоамилазы определяли глюкозооксидазным методом с помощью набора реактивов для измерения концентрации глюкозы в биологических жидкостях ("OLVEX DIAGNOSTICUM", Россия).
Расчет каталитической активности (А) глюкоамилазы проводили по формуле:
b х 1801'
где а — количество глюкозы, образовавшейся в 1 мл гидролизата, мкг; b — количество фермента в 1 мл гидролизата, мг/мл; t — время гидролиза, мин; 180 — молекулярная масса глюкозы.
В качестве субстрата использовали растворимый картофельный крахмал фирмы "Экрос".
Сорбционную иммобилизацию фермента проводили на коллагене, выделенном ферментативным методом из соединительной ткани крупного рогатого скота на кафедре технологии мяса и мясопродуктов Воронежского государственного университета инженерных технологий [11].
Для осуществления сорбционной иммобилизации 5 г коллагена оставляли на 12 ч при комнатной температуре в 25.6 мл ацетатного буфера (рН 4.5). Затем 5 мл раствора фермента (10-5 моль/л) добавляли к суспензии носителя и перемешивали в колбе с помощью магнитной мешалки в течение 1.5 ч при 25°С. Центрифугировали при 3000 об./мин 5 мин, осадок промывали ацетатным буфером (рН 4.5), далее — дистиллированной водой до отсутствия в промывных водах белка (контроль содержания белка осуществляли на спектрофотометре "Shimadzu RF-5301 РС" (Япония)) при X = 280 нм) [12].
Концентрацию белка в иммобилизованном образце определяли модифицированным методом Лоури [13], инкубацию иммобилизованного фермента с субстратом осуществляли при перемешивании с помощью магнитной мешалки в течение 30 мин.
УФ-облучение растворов нативной и иммобилизованной глюкоамилазы проводили при постоянном перемешивании в термостатируемой кювете (20 ± 1°С) с помощью ртутно-кварцевой лампы типа ДРТ-400 через светофильтр УФС-1 с полосой пропускания 240—390 нм на расстоянии от облучателя 10 см с интенсивностью 0.15 кДж/м2 в мин.
Математическую обработку результатов экспериментов проводили с помощью интегрированного пакета статистической обработки данных '^1а1§гарЫс8". Достоверность отличий контрольных и экспериментальных результатов оценивали с использованием стандартного ¿-критерия Стьюдента при уровне значимостир < 0.05.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Была осуществлена сорбционная иммобилизация глюкоамилазы на коллагене.
Анализ результатов экспериментов свидетельствует о том, что глюкоамилаза, связанная с коллагеном, сохраняет 70% от каталитической активности нативного энзима. Каталитическая активность свободного фермента составляет 11.6 ед/мг, а иммобилизованного — 8.1 ед/мг.
В связи с тем, что основными параметрами, влияющими на каталитическую активность свободного и иммобилизованного ферментов, являются температура, концентрация ионов водорода, концентрация субстрата — крахмала, изучали зависимость скорости реакции гидролиза субстрата от данных параметров [14].
Установлено, что для глюкоамилазы, адсорб-ционно иммобилизованной на коллагене, температурный оптимум смещается в сторону более высоких значений с максимальной активностью при 55°С, что на 5°С выше, чем для нативного фермента (рис. 1).
Обнаружено, что при иммобилизации на коллагене каталитическая активность сохраняется при 95°С, в то время как свободный фермент полностью инактивируется при 90°С. Оптимум рН-активности для свободного фермента составляет 4.7 единиц. При адсорбционной иммобилизации на коллагене имеет место расширение значений рН (4.5—5.0), при которых гетерогенный ферментный препарат проявляет максимальную каталитическую активность (рис. 2).
С помощью преобразования кривых зависимости V от S в координатах Лайнуивера—Берка, Хейнса и Иди—Хофсти нами были определены
A, ед./мг 12
10
8
6
4
2
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110
t, °C
Рис. 1. Зависимость каталитической активности свободной и иммобилизованной глюкоамилазы из Aspergillus awamori от температуры: 1 — свободный фермент; 2 — глюкоамилаза, адсорбционно связанная с коллагеном.
кажущиеся Кт и Vmax реакции гидролиза глюкоамилазы гетерогенными ферментными препаратами. Показано, что иммобилизация приводит к увеличению значений константы Михаэлиса и уменьшению максимальной скорости реакции по сравнению с нативным энзимом. Константа Ми-хаэлиса для нативного фермента составляет 0.24 х 10-5 моль/л, а для иммобилизованного — 0.45 х 10-5 моль/л, Vmax реакции гидролиза крахмала для свободного фермента составляет 15.5 мкмоль • мг/мин, а для адсорбционно связанного — 10.2 мкмоль • мг/мин.
A, ед./мг 14
A, ед./мг 12
10 8 6 4 2
0
3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5
pH
Рис. 2. Зависимость каталитической активности свободной и иммобилизованной глюкоамилазы из Aspergillus awamori от концентрации ионов водорода: 1 — свободный фермент; 2 — глюкоамилаза, адсорбционно связанная с коллагеном.
12 10 8 6 4 2
1 2
1 2 -I-
1 2 -Ï-
1 2 I I
10 30 60
Время инкубирования, мин
Рис. 3. Влияние фотоокисления гистидина и триптофана в присутствии метиленовой сини на каталитическую активность глюкоамилазы: 1 — свободный фермент, без метиленовой сини; 2 — глюкоамилаза в присутствии метиленовой сини.
Были изучены УФ-индуцированные изменения каталитической активности глюкоамилазы в нативном состоянии и в присутствии фотосенсибилизатора метиленового голубого.
Установлено, что константа скорости фотоинактивации глюк
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.