МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 2013, том 47, № 5, с. 796-805
МОЛЕКУЛЯРНАЯ ^^^^^^^^^^^^ БИОЛОГИЯ КЛЕТКИ
УДК 591.169.1
ВОЗМОЖНАЯ РОЛЬ АКТИВАЦИИ АУТОФАГИИ В СТИМУЛЯЦИИ РЕГЕНЕРАЦИИ
© 2013 г. Х. С. Вишнякова1, К. В. Попов13, Е. А. Воротеляк2, Р. Р. Файзуллин2,
А. С. Артюхов2,3, Е. Е. Егоров1, 3*
Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук, Москва, 119991 2Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова Российской академии наук, Москва, 119071 3Московский физико-технический институт (государственный университет), Долгопрудный,
Московская обл., 141700 Поступила в редакцию 26.02.2013 г. Принята к печати 25.03.2013 г.
Старение клеток человека происходит неравномерно. Стареющие клетки часто нарушают функции соседних клеток, еще не подверженных старению. Стимуляция регенерации тканей может иметь огромное практическое значение в медицине, особенно в гериатрии. Один из возможных способов индукции регенерации состоит в избирательном удалении из ткани стареющих и поврежденных клеток. В ходе изучения механизма действия средства для стимуляции роста волос (бальзам "Satura rosta") было обнаружено, что препарат не стимулирует пролиферацию различных клеток человека и не повышает их устойчивость к стрессу. Наоборот, в условиях окислительного стресса препарат становился цитотоксическим, хотя и не вызывал увеличения продукции активных форм кислорода. В дальнейшем показано, что препарат повышает транскрипционную активность гена р53, активирует аутофагию и вызывает слабую адипогенную дифференцировку. Обсуждается гипотеза аутофагической регенерации, согласно которой избирательная аутофагическая гибель старых и поврежденных клеток, находящихся в состоянии окислительного стресса, запускает процесс регенерации, который может усиливаться как за счет омолаживающего эффекта усиления аутофагии, так и за счет высвобождения дополнительных метаболитов.
Ключевые слова: аутофагия, пролиферация, волосы, облысение, клетки человека, "Satura® Rosta", регенерация.
POSSIBLE ROLE OF AUTOPHAGY ACTIVATION IN THE STIMULATION OF REGENERATION by K. S. Vishnyakova1, X. V. Popov1'3, Е. A. Vorotelyak2, R. R. Faizullin2, A. S. Аrtyukhov2'3, Y. Е. Yegorov1'3 (1Engelhardt Institute of Molecular Biology, Russian Academy of Sciences, Moscow, 119991 Russia; *e-mail: yegorov58@gmail.com; 2Koltzov Institute of Developmental Biology, Russian Academy of Sciences, Moscow, 119071 Russia; 3Moscow Institute of Physics and Technology, Dolgoprudny, Moscow Region, 141700 Russia). Human cell senescence occurs unevenly and senescent cells in tissues frequently can disturb the function of neighbouring nonsenescent ones. Setting of tissues regeneration can have profound practical significance in medicine, especially in geriatrics. One of the approaches to solve the problem is selective elimination of senescent and damaged cells from the tissues that can be the first phase of the process. During the investigation of the mechanisms of action of the preparation for hair growth stimulation it was discovered that this preparation does not stimulate proliferation of various human cells and does not increase the resistance of cells to stress. On the contrary the preparation becomes cytotoxic at the conditions of oxidative stress although on its own account it did not induce elevation of production of reactive oxygen species. Further investigations showed that the preparation increases transcriptional activity ofp53 gene, increase autophagy level and induce weak adipogenic differentiation. The hypothesis of autophagic regeneration is discussed. As a result, the selective autophagic cell death of any senescent and damaged cells that undergoes oxidative stress triggers the regeneration process which can be increased by both the rejuvenation effect of increased autophagy and at the expense of nutrients released during the autophagy.
Keywords: autophagy, proliferation, hair, baldness, human cells, "Satura® Rosta", regeneration. DOI: 10.7868/S0026898413050212
*Эл. почта: yegorov58@gmail.com
Термин аутофагия ввел в 1963 г. лауреат Нобелевской премии Христиан де Дюв. В настоящее время под аутофагией в широком смысле подразумевают процесс доставки цитоплазматического материала в лизосомы [1].
Аутофагия происходит в клетках постоянно и может стимулироваться различными стрессовыми обстоятельствами. В добавление к гомеостати-ческим функциям расщепления макромолекул с образованием низкомолекулярных компонентов, используемых клеткой для своих нужд, и очистки клеток от неправильно свернутых белков и поврежденных органелл, аутофагия абсолютно необходима при различных физиологических и патологических состояниях, таких как раннее эмбриональное развитие, деградация белков, способных к агрегации или образовавших сшивки, освобождение от бактерий. Нарушения аутофагии проявляются при различных заболеваниях — от инфекционных до рака и нейродегенерации [2].
Действие аутофагии, направленное против процессов старения, в последние несколько лет стало общепризнанным фактом. Различные воздействия, замедляющие старение, в том числе снижение калорийности питания, не эффективны в условиях подавления аутофагии [3]. Увеличение продолжительности жизни нематод и мух под действием ра-памицина, спермидина и ресвератрола частично опосредовано аутофагией [4]. И, наоборот, при искусственном торможении аутофагии развиваются состояния, напоминающие преждевременное, часто сегментарное старение [1]. Показано, что индукция аутофагии способна остановить потерю стволовых клеток волоса и предотвратить тем самым облысение мышей с искусственно повышенной экспрессией гена Wn.i1 [5].
Облысение и поседение считаются признаками старения. В последние годы растет интерес к изучению волосяных фолликулов, которые могут стать очень перспективной моделью для изучения старения клеток, тканей и человека в целом.
Рост волос происходит повторяющимися циклами. Цикл начинается стадией роста волосяного фолликула — анагеном, далее наступает дегенерация — катаген, переходящая в телоген — стадию покоя [6]. Продолжительность такого цикла у человека может составлять несколько лет. Примечательно, что один и тот же фолликул способен циклично проходить через все эти изменения, возвращаясь к очень интенсивному росту после продолжительного покоя.
Изменения, происходящие в коже, безусловно, должны влиять на рост волоса. Старение кожи сопряжено, в частности, с истончением слоя жировой клетчатки, уменьшением общего содержания клеток и снижением интенсивности метаболизма [7]. Эти изменения постепенно накапливаются и все более затрудняют рост волос. Однако
нарушения, приводящие к облысению и поседению, возникают существенно раньше, чем развивается классический фенотип старой кожи. Возможно, в данном случае мы имеем дело с сегментарным старением, которое захватывает непосредственно волосяные фолликулы.
Гипотетически существует множество мишеней, на которые могут воздействовать препараты от облысения. Среди этих препаратов выделяются прежде всего те, которые препятствуют старению и усиливают регенерацию. Недавно было доказано, что избирательная элиминация стареющих клеток способна задерживать развитие ассоциированных со старением патологий [8]. Можно предположить, что средства от облысения могут оказывать общеомолаживающее действие, поэтому мы решили выбрать в качестве объекта изучения бальзам "Satura® Rosta"^CP). Многие годы БСР используется как эффективное средство от облысения, однако механизм его действия неизвестен. Фактором, способствующим этому выбору, было также согласие представителей производителя предоставить нам активное начало препарата в чистом виде.
В представленной работе мы изучали возможные механизмы действия БСР в культуре клеток.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Препарат "Satura® Rosta". БСР с 1989 года производится фирмой "Propico Inc." (Великобритания) и используется для стимуляции роста волос. За это время БСР показал высокую эффективность в России, США, Великобритании, Израиле и других странах. Препарат имеет многочисленные сертификаты эффективности и соответствия санитарно-гигиеническим нормам для косметических препаратов. Точный состав препарата является коммерческой тайной фирмы "Propico Inc.". Фирма предоставила нам основу БСР, которая составляет 5% коммерческого препарата, а генеральный директор фирмы доктор Г.В. Зигмонд сообщила, что основа состоит из переработанного экстракта различных водорослей. Эту основу мы использовали для работы с клетками (1%-ный спиртовой раствор).
Культуры клеток. Первичные культуры фиб-робластов кожи человека (штамм 1608) и клеток волосяного сосочка (дермальной папиллы) человека любезно предоставлены С.М. Тереховым (МГНЦ РАМН). Клон иммортализованных фиб-робластов кожи человека получен в результате введения гена hTERT в клетки 1608 как описано ранее [9, 10]. Иммортализованные клетки дермальной папиллы (DP-hTERT) получены путем лентивирусной трансфекции первичной культуры геном hTERT. Свойства этих клеток описаны в [11]. Первичные кератиноциты человека выделя-
ли из образцов кожи, полученных в ходе пластических операций. Использовали также линию HaCaT иммортализованных неопухолевых керати-ноцитов человека. Культуры стромальных клеток костного мозга мышей С3Н получены согласно [12]. Эти клетки культивировали при пониженной (3%) концентрации кислорода в инкубаторе Ther-moForma, модель 484 (США).
Клетки, за исключением первичных кератино-цитов, росли в среде DMEM ("ПанЭко", Россия) с добавлением 10% эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота (ЭТС) ("HyClone"), 2 мМ Z-глутамина ("ПанЭко") и 40 мкг/мл гентамицина ("ПанЭко") при 37°C и 5% CO2. Первичные кера-тиноциты культивировали в среде DMEM : F12 (1 : 1) с добавлением 10% ЭТС, 2 мМ Z-глутами-на, 40 мкг/мл гентамицина, 10 нг/мл эпидер-мального фактора роста (EGF), 5 мкг/мл инсулина и 0.25 мкг/мл изопротеренола. MTT-анализ проводили согласно [13]. Клетки и препараты фотографировали с помощью инвертированного фа-зово-контрастного микроскопа Nikon Diavert (Япония) и камеры Nikon D5000 (Япония). Изображения контрастировали с пом
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.