ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2014, том 61, № 2, с. 170-176
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 581.1
ВОЗМОЖНОЕ УЧАСТИЕ ЦИАНОБАКТЕРИЙ В ФОРМИРОВАНИИ ГОРМОНАЛЬНОЙ СИСТЕМЫ РАСТЕНИЙ
© 2014 г. Г. В. Шевченко, Н. Н. Каравайко, С. Ю. Селиванкина, Н. К. Зубкова, Е. В. Куприянова, Д. А. Лось, В. В. Кузнецов, О. Н. Кулаева
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН, Москва Поступила в редакцию 25.03.2013 г.
Впервые показано присутствие в цианобактерии Synechocystis sp. PCC 6803 растворимого цитоки-нин-связывающего белка с мол. м. 67 кД (ЦСБ67). Выделение ЦСБ67 проводили двумя независимыми методами: с помощью аффинной хроматографии на зеатин-сефарозе и путем иммуноаффин-ной хроматографии с использованием моноклональных антител (мкАТ), полученных к ЦСБ70 (70 кД) кукурузы. Цитокинин-связывающие свойства ЦСБ67 установлены по его взаимодействию с антиидиотипическими антителами (АТа-и), которые были получены против АТ к зеатину и являются, по сути, АТ к зеатин-связывающему сайту белка. Показана высокая специфичность взаимодействия транс-зеатина с ЦСБ67. Взаимодействие было снижено у зеатинрибозида и цис-зеатина и отсутствовало у других фитогормонов (ауксина, гибберелловой кислоты и абсцизовой кислоты), а также у аденина. ЦСБ67 цианобактерий активировал транскрипцию in vitro в лизате Synechocystis. Совместное действие ЦСБ67 и транс-зеатина давало наибольший эффект. ЦСБ67 Synechocystis активировал также транскрипцию в лизате хлоропластов ячменя. Совокупность полученных результатов указывает на возможность существования систем восприятия сигнала цитокинина у эволюционного предшественника хлоропластов — цианобактерий, которые могли привнести эту систему в растительную клетку.
Ключевые слова: Synechocystis — хлоропласты - цитокинины — цитокинин-связывающие белки - цито-кинин-зависимаярегуляция транскрипции — эволюция гормональной системы
Б01: 10.7868/80015330314020158
ВВЕДЕНИЕ
Большая роль в регуляции биогенеза хлоропластов принадлежит цитокининам. Хорошо изучена активация цитокинином структурной и биохимической дифференциации хлоропластов [13]. В хлоропластах присутствует большой набор физиологически активных цитокининов [4-6]. Показано, что цитокинин может активировать транскрипцию ряда хлоропластных генов [7].
Существует представление о том, что хлоропласты произошли в результате эндоцитоза древних фотосинтезирующих цианобактерий в эука-риотическую клетку [8, 9]. В связи с этим, большой интерес представляет обнаружение цитокининов в цианобактериях. 81кк с соавт. [10] показали присутствие в цианобактериях изопен-
Сокращения: АТ — антитела; мкАТ — моноклональные антитела; ТФС - фосфатно-солевой буфер с Твин 20; ЦСБ — ци-токинин-связывающий белок.
Адрес для корреспонденции: Шевченко Галина Васильевна. 127276 Москва, Ботаническая ул., 35. Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН. Факс: 007 (499) 977-80-18; электронная почта: gshevchenko@mail.ru
тиниладенина. В последующем, в цианобактериях идентифицированы также транс- и цис-зеа-тин, зеатинрибозид и зеатин-О-глюкозид [11]. Кроме того, показано влияние транс-зеатина на активность РНК-полимеразы цианобактерий in vitro в лизате клеток Synechocystis, содержащем ДНК, регуляторные белки и РНК-полимеразу цианобактерий [12]. Существенно, что выделенный ранее из хлоропластов листьев ячменя цито-кинин-связывающий белок, участвующий в ци-токинин-зависимой регуляции транскрипции в хлоропластах растений и не участвующий в гормон-зависимой активации транскрипции в ядрах, усиливал реакцию на транс-зеатин в транскрипционной системе цианобактерий [12]. Эти данные позволяют предполагать, что у цианобак-терий существует регуляторная система с участием цитокининов, которую они могли бы привнести в растительную клетку. Однако очевидно, что элементы этой системы могли претерпеть в растениях значительные изменения.
До настоящего времени не было работ, посвященных поиску цитокинин-связывающих белков
ВОЗМОЖНОЕ УЧАСТИЕ ЦИАНОБАКТЕРИЙ В ФОРМИРОВАНИИ
171
цианобактерий, которые могли бы быть молекулярными мишенями этого фитогормона и участвовать в его влиянии на метаболизм клеток, хотя актуальность такой постановки вопроса очевидна с точки зрения анализа роли цианобактерий в эволюции гормональной системы растений.
В связи с этим, задачей нашей работы был поиск цитокинин-связывающих белков в ци-анобактерии БупгскосунИн 8р. РСС 6803 и изучение их активности.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Объектом исследования являлся штамм ци-анобактерии Synechocystis sp. PCC 6803 ("Du Pont", США). Цианобактерии культивировали в течение трех дней фотоавтотрофно в стерильных условиях на среде BG11, при температуре 34°С, при постоянном освещении 70 мкмоль/(м2 с) квантов света и барботировании газо-воздушной смесью, содержащей 2% СО2.
Выделение цитокинин-связывающих белков (ЦСБ). Выделение ЦСБ проводили из водорастворимой фракции лизата Synechocystis. Клетки разрушали механически с помощью стеклянных бус G4649 ("Sigma", США) в среде, содержащей 50 мМ Трис-HCl (pH 8.0), 10 мМ MgCl2, 10 мМ KCl и 4 мМ 2-меркаптоэтанола, затем центрифугировали при 160000 g в течение 2 ч при 4°С. Полученный супернатант использовали для дальнейших исследований. Для выделения ЦСБ использовали гидрофобную хроматографию на фенил-сефарозе. Фракцию белков в буфере выделения с добавлением NaCl до концентрации 2 М наносили на колонку (2.6 х 12 см) с фенил-сефа-розой ^-4В ("GE Healthcare", США), уравновешенную буфером 50 мМ Трис-HCl (рН 7.7), 10 мМ MgCl2, 2 М NaCl. Не связавшиеся белки удаляли промывкой фенил-сефарозы тем же буфером. Элюцию белков, связавшихся с фенил-се-фарозой, проводили последовательно: 1) нисходящим градиентом NaCl в концентрации от 2 до 0М в 20 мМ Трис-HCl (рН 7.7); 2) 20 мМ Трис-HCl (рН 7.7); 3) дистиллированной H2O.
Фракцию белков, содержащую ЦСБ Synechocystis, выделяли из очищенной на фенил-се-фарозе фракции лизата двумя методами.
Аффинная хроматография. При выделении методом аффинной хроматографии использовали зеатин-сефарозу, полученную иммобилизацией зеатинрибозида на АН-сефарозе 4В ("GE Healthcare") периодатным методом [13]. Объем колонки -2.6 х 6 см. Матрикс предварительно уравновешивали 20 мМ Трис-HCl (рН 7.7) с 0.2 М NaCl, после чего наносили фракцию белков. Несвязанные белки отмывали тем же буфером, затем 1 М NaCl в 50 мМ Трис-HCl (рН 8.3). Элюцию проводили 0.2 М №ОН или транс-зеатином в концентрации
10-5 М в буфере, содержащем 1 М NaCl в 50 мМ Трис-HCl (рН 8.3).
Иммуноаффинная хроматография. При выделении ЦСБ методом иммуноаффинной хроматографии использовали моноклональные АТ (мкАТ) к ЦСБ 70 кД из этиолированных проростков кукурузы, предоставленные Ф.А. Бровко (Филиал института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, Пущино Московской обл.). мкАТцСБ70 иммобилизовали на CNBr-активированную се-фарозу 4В ("GE Healthcare") согласно методическим рекомендациям фирмы "GE Healthcare". Белки наносили на колонку (1.4 х 3 см) в буфере, содержащем 50 мМ KCl, 2 мМ ЭДТА, 2 мМ MgCl2, 20 мМ Трис-HCl (рН 8.0). Элюцию проводили 0.2 N NH4OH.
Получение антиидиотипических Ат (АТа-и) к транс-зеатину. АТ^и выделяли при помощи двойной иммунизации кроликов. На первом этапе выделяли АТ к транс-зеатину из поликлональных сывороток, полученных на транс-зеатин с помощью аффинной хроматографии на транс-зеатин-сефарозе. Очищенные АТ к зеатину использовали для повторной иммунизации. АТа_и выделяли из полученной сыворотки с помощью хроматографии на сефарозе с иммобилизованными AT к транс-зеатину. Очищенные АТ^ использовали для ИФА в качестве АТ против зеатин-связываю-щего сайта белковой молекулы [14].
Детектирование ЦСБ методом твердофазного
ИФА. На всех этапах работы присутствие ЦСБ устанавливали с помощью АТ^ к транс-зеатину. Детектирование ЦСБ проводили в тест-системе твердофазного ИФА. Для этого исследуемую белковую фракцию иммобилизовали при 4° С в лунках полистиролового планшета в течение ночи. Затем лунки промывали фосфатно-солевым буфером с Твин 20 (ТФС-буфер: 20 мМ фосфатный буфер рН 7.4, содержащий 150 мМ NaCl и 0.2% Твин 20), после чего в них вносили АТ^ в ТФС-буфере с добавлением 1% овальбумина и инкубировали в течение 1 ч при 37°С. После промывки ТФС-буфером и дистиллированной H2O в систему в том же буфере, что и АТ^ вносили ослиные противокроличьи иммуноглобулины, меченные пероксидазой хрена ("Медгамал", Россия). После инкубации в течение 1 ч при 37°С лунки промывали ТФС-буфером и дистиллированной H2O. Активность пероксидазы измеряли, используя в качестве хромогена ортофенилендиамин. Интенсивность хромофорного сигнала измеряли при 490 нм на 8-канальном спектрофотометре вертикального сканирования Labsystems Multiscan МСС-340 ("Flow Laboratories", Великобритания).
Определение специфичности связывания ЦСБ с фитогормонами проводили в конкурентной систе-
ме твердофазного ИФА. ЦСБ иммобилизовали в лунках полистиролового планшета в течение ночи при 4°С, не связавшиеся белки отмывали ТФС-буфером. Затем вносили АТа-и и тестируемые на связывание с белками соединения в различных концентрациях (АБК, цис-, транс-зеа-тин, зеатинрибозид, ИУК, ГК и аденин) и инкубировали при 4°С в течение ночи. Это позволяло определить способность соединений вытеснять АТа-и из комплекса с белком и таким путем оценить специфичность связывания цитокинина с ЦСБ. После отмывания ТФС-буфером вносили вторичные противокроличьи AT, меченные пе-роксидазой хрена ("Медгамал"), и измеряли хромофорный ответ при 490 нм на спектрофотометре Labsystems Multiscan MS ("Labsystems", Великобритания).
Активность ЦСБ и цитокининов в регуляции транскрипции изучали в системе синтеза РНК in vitro, представляющей собой супернатант водорастворимой фракции лизата клеток Synechocys-tis, отделенный от нерастворимой фракции центрифугированием при 15 000 g в течение 30 мин. В супернатанте присутствовали ДНК, РНК-поли-мераза, белковые факторы, необходимые для процесса транскрипции [12]. О синтезе РНК судили по включению в нее меченного предшественника [3Н]-УМФ. Радиоактивность определяли на сцинти
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.