БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕМБРАНЫ, 2015, том 32, № 2, с. 119-124
УДК 577.352.465
ВОЗМОЖНЫЙ МЕХАНИЗМ РЕГУЛЯЦИИ ПОТЕНЦИАЛ-ЗАВИСИМЫХ Са2+-КАНАЛОВ ВКУСОВЫХ КЛЕТОК НАРУЖНЫМ Са2+
© 2015 г. А. П. Черкашин1, Х. Жао2, С. С. Колесников1*
Институт биофизики клетки РАН, 142290, Пущино, Московская обл., ул. Институтская, 3; *электронная почта: staskolesnikov@yahoo.com 2Институт биомеханики и медицинской инженерии, Университет Тсинхуа, 100084, Пекин, КНР
Поступила в редакцию 06.12.2014 г.
Вкусовая почка представляет собой плотный ассоциат 50—100 клеток, расстояние между которыми существенно меньше характерного клеточного размера, в связи с чем объем внеклеточного пространства на два порядка меньше внутриклеточного. Поэтому электрическая активность клеток может приводить к заметным изменениям содержания основных физиологически важных ионов во внеклеточной среде, включая ионы Са2+, за счет перераспределения ионов между цитоплазмой и внеклеточной средой. Хотя популяция клеток вкусовой почки включает вкусовые клетки нескольких типов, потенциал-зависимые (ПЗ) Са2+-каналы функциональны только в клетках типа III. В данной работе анализировали зависимость ПЗ Са2+-тока во вкусовых клетках от концентрации внеклеточного Са2+. Было установлено, что на зависимости ПЗ Са2+-тока от концентрации внеклеточного Са2+ имеется плато. Это указывает на существование механизма, который регулирует активность ПЗ Са2+-каналов, чтобы обеспечить инвариантность потока Са2+ в физиологически значимом диапазоне концентраций (1—2 мМ) наружного Са2+. Предложена математическая модель, в которой предполагается, что гептаспиральный рецептор CASR (extracellular Са2+-8ешт§ receptor) вовлечен в регуляцию активности ПЗ Са2+-каналов. В модели постулируется, что внеклеточный Са2+ влияет на уровень ПЗ Са2+-тока не только как носитель тока, но и как CASR-опосредованный регулятор ПЗ Са2+-каналов. При определенных параметрах модель достаточно точно воспроизводит полученную экспериментальную зависимость величины ПЗ Са2+-тока от концентрации внеклеточного Са2+.
Ключевые слова: вкусовые клетки, ПЗ Са2+-каналы, внеклеточный Са2+, рецептор внеклеточного Са2+.
DOI: 10.7868/S023347551502005X
ВВЕДЕНИЕ
Внутриклеточный Са2+ широко известен как универсальный регулятор самых разнообразных клеточных функций. Существующие представления о процессах внутриклеточной Са2+ сигнализации, механизмах Са2+ гомеостаза и/или Са2+-зави-симых внутриклеточных процессах преимущественно базируются на данных, полученных in vitro в условиях, когда внеклеточная среда фактически является неисчерпаемым источником кальция. Между тем, в биологических тканях in vivo Са2+ гомеостаз включает перераспределение Са2+ между весьма ограниченной внеклеточной средой и существенно большей (примерно на два порядка) по объему цитоплазмой клетки. В частности, в клетках многих типов вход Са2+ из внеклеточного пространства служит триггером и/или ключевым событием во внутриклеточной сигнализации. Уровень внутриклеточного Са2+ в покое (~100 нМ) на четыре порядка ниже концентрации внеклеточ-
ного Са2+ (~1 мМ). На первый взгляд, при столь существенной разнице концентраций даже многократное изменение уровня свободного Са2+ в цитозоле за счет входа наружного Са2+ не должно сопровождаться существенным изменением последнего. Следует, однако, учесть, что внутриклеточный кальциевый буфер связывает не менее 99% ионов Са2+, входящих в цитоплазму извне [1]. В силу этого повышение свободного Са2+ в цитозоле до ~1 мкМ, что нередко наблюдается при возбуждении клеток, требует изменения суммарного Са2+ (свободный + связанный) не менее чем на ~100 мкМ. Последнее эквивалентно уменьшению внеклеточного Са2+ на 1—10 мМ, если отношение внутриклеточного и внеклеточного объемов составляет 10—100. Хотя приведенная оценка весьма груба, она свидетельствует о том, что in situ существенное изменение уровня внутриклеточного Са2+ за счет входа Са2+ не может происходить без заметного изменения Са2+ в
120
ЧЕРКАШИН и др.
межклеточной среде. Этот факт обычно игнорируется или недооценивается.
Вкусовая почка представляет собой плотный ассоциат 50—100 клеток, расстояние между мембранами которых составляет около 100 А [2, 3]. Последнее означает, что по объему внеклеточное пространство во вкусовой почке на два порядка меньше внутриклеточного, и поэтому электрическая активность клеток может приводить к заметным изменениям содержания основных физиологически важных ионов во внеклеточной среде. Популяция клеток вкусовой почки неоднородна и включает вкусовые клетки трех типов (тип I — тип III) [2]. Потенциал-зависимые (ПЗ) Са2+-ка-налы функциональны только в клетках типа III [4, 5], которые формируют классические химические синапсы с вкусовым нервом и высвобождают нейротрансмиттер по механизму Са2+-зависи-мого экзоцитоза, стимулируемого ионами Са2+, входящими через ПЗ Са2+-каналы [6]. Синапти-ческая щель является внеклеточным компартмен-том весьма малого объема и с ограниченным диффузионным обменом. Вполне вероятно поэтому, что после прихода нескольких потенциалов действия, стимулирующих вход Са2+ в синаптическую терминаль через ПЗ Са2+-каналы, наблюдается заметное истощение Са2+ в синаптической щели. Последнее неизбежно приведет к пропорциональному падению ПЗ Са2+-тока и уменьшению количества нейротрансмиттера, выброшенного в ответ на последующий потенциал действия, т.е. к снижению эффективности синаптической передачи. Физиологически целесообразным представляется поэтому существование механизма, который обеспечил бы более или менее инвариантный выброс нейромедиатора при варьируемой концентрации Са2+ в синаптической щели и во внеклеточном пространстве в целом. В настоящей работе мы проводили экспериментальную проверку этой идеи, анализируя зависимость амплитуды ПЗ Са2+-токов во вкусовых клетках типа III от концентрации внеклеточного Са2+.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Электрофизиология. Эксперименты проводили на одиночных вкусовых клетках, изолированных из желобоватого сосочка языка мыши (6—12 нед.), как описано ранее [7]. Электрическую активность вкусовых клеток регистрировали методом patch-clamp в конфигурации perforated patch с использованием усилителя Axopatch 200 B, ЦАП-АЦП конвертера Digidata 1440A и пакета лицензионных программ pClamp10.3 (все Axon Instruments, Сингапур). Клетки в электрофизиологической камере визуализовали с использованием микроскопа Axioscop-2 (Carl Zeiss, Германия) и объектива LD A-Plan х32. Базовый внутриклеточный
раствор содержал, мМ: 140 CsCl, 1 MgCl2, 0.1 EGTA, 10 HEPES-CsOH, Amphotericin B (400 мкг/мл), pH 7.3. Базовый внеклеточный раствор содержал, мМ: 135 NaCl, 5 KCl, 0.8 MgCl2, 2 CaCl2, 10 HEPES-NaOH (NaOH), pH 7.4. Система перфузии [8] обеспечивала смену раствора камеры со скоростью 0.1—1 мл/с. Опыты проводили при комнатной температуре 22—24°C. Все соли и реагенты приобретались в Sigma—Aldrich (США).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Электрическую активность одиночных вкусовых клеток анализировали методом perforated patch [9], чтобы предотвратить потерю внутриклеточных компонент и ассоциированную с этим инактивацию ПЗ Са2+-каналов. Регистрацию проводили в условиях диализа клеток раствором, содержащим 140 мМ CsCl, что обеспечивало подавление выходящих токов через ПЗ К+-каналы. Это облегчало функциональную идентификацию вкусовых клеток типа III [10] и позволяло регистрировать относительно небольшие входящие токи через ПЗ Са2+-каналы. Когда клетки типа III перфу-зировали раствором, содержащим 140 мМ NaCl + + 1 мМ Са02, их деполяризация вызывала быстрые входящие токи, блокируемые тетрододокси-ном (TTX), т.е. транспортируемые ПЗ №+-кана-лами, и медленно инактивирующиеся входящие ПЗ Са2+-токи небольшой амплитуды (10—30 пА), не вполне хорошо разрешимые из-за электрических шумов (рис. 1а). Ионные токи через ПЗ Са2+-каналы были хорошо различимы в условиях блокады ПЗ Na-токов тетродотоксином (TTX), и когда в качестве носителя использовали Ba2+ (4— 10 мМ) (рис. 1б). Вольт-амперные (I—V) характеристики этих токов показывали, что они переносятся преимущественно через высокопороговые ПЗ Са2+-каналы (рис. 1в). Важной особенностью исследованных ПЗ Са2+-каналов было то, что они полностью блокировались ионами Cd2+ в концентрации до 50 мкМ (рис. 1в), причем блокирование было полностью обратимым при непродолжительной (до 30 c) аппликации блокатора. Это позволяло количественно оценивать ПЗ Са2+-то-ки, которые были весьма невелики при физиологических концентрациях внеклеточного Са2+, как разность Са2+-токов, регистрируемых в присутствии/отсутствие 50 мкМ Cd2+.
Различные модели переноса, предполагающие связывание проникающего иона в поре ионного канала, предсказывают, что при фиксированном потенциале ионный ток как функция концентрации носителей должен описываться кривой с насыщением типа изотермы Ленгмюра [11]. Это подтверждается экспериментально и в случае одиноч-
ВОЗМОЖНЫЙ МЕХАНИЗМ РЕГУЛЯЦИИ ПОТЕНЦИАЛ-ЗАВИСИМЫХ Са2+-КАНАЛОВ а -10 мВ
-70 мВ
Н-
60 мВ
50 мкМ Cd
2+
70 мВ
50 0
100
-200
-60 -40 -20 0 20 40 60 Мембранный потенциал, мВ
к
о т
й ы н
л
л
а р
Í-C
В
н И
Рис. 1. ПЗ ионные токи во вкусовых клетках типа III в условиях диализа раствором, содержащим 140 мМ CsCl. а — Входящие Na+ (/Na, пунктирная кривая) и Ca2+ (Ica, тонкая линия) токи, регистрируемые от вкусовой клетки в ответ на деполяризацию 100 мс импульсом (верхняя панель) — 10 мВ. Клетку поддерживали при потенциале -70 мВ и перфу-зировали раствором, содержащим 140 мМ NaCl + 1 мМ CaC^. б -Репрезентативное семейство Ва2+-токов через ПЗ каналы, регистрируемых от вкусовой клетки в ответ на деполяризацию в промежутке между -50 и 60 мВ. В на-
Са2
ружном растворе - 140 мМ NaCl + 4 мМ BaCl2 + 1 мкМ TTX. в - /—V-характеристика стационарного Ва2+ -тока в кон
троле (семейство токов в б) и в присутствии 50 мкМ Cd2+ (оригинальные регистрации не показаны).
ных Са2+-каналов, у которых величина тока через канал I хорошо описывается уравнением [12]:
■¿Ca
0/2 + a
(1)
Ca
I = I P*- тя Y-*-
C
C1/2 + C
(3)
где аСа — активность ионов Са2+, а1//2 — активность полуэффекта, /шах — величина тока при а
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.