научная статья по теме ВОЗРАСТНЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ ЧУВСТВИТЕЛЬНЫХ НЕЙРОНОВ, СОДЕРЖАЩИХ КАЛЬЦИТОНИН ГЕН РОДСТВЕННЫЙ ПЕПТИД В УСЛОВИЯХ ДЕФИЦИТА АФФЕРЕНТАЦИИ У КРЫСЫ Биология

Текст научной статьи на тему «ВОЗРАСТНЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ ЧУВСТВИТЕЛЬНЫХ НЕЙРОНОВ, СОДЕРЖАЩИХ КАЛЬЦИТОНИН ГЕН РОДСТВЕННЫЙ ПЕПТИД В УСЛОВИЯХ ДЕФИЦИТА АФФЕРЕНТАЦИИ У КРЫСЫ»

ОНТОГЕНЕЗ, 2012, том 43, № 6, с. 405-412

ФИЗИОЛОГИЯ РАЗВИТИЯ =

УДК 611.832:612.822

ВОЗРАСТНЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ ЧУВСТВИТЕЛЬНЫХ НЕЙРОНОВ, СОДЕРЖАЩИХ КАЛЬЦИТОНИН ГЕН РОДСТВЕННЫЙ ПЕПТИД В УСЛОВИЯХ ДЕФИЦИТА АФФЕРЕНТАЦИИ У КРЫСЫ © 2012 г. В. В. Порсева, А. А. Стрелков, В. В. Шилкин, П. М. Маслюков

ГОУВПО "Ярославская государственная медицинская академия"Минздравсоцразвития России

150000Ярославль, ул. Революционная, д. 5 E-mail: vvporseva@mail.ru Поступила в редакцию 24.06.11 г. Окончательный вариант получен 02.12.11 г.

Морфологические особенности КГРП-иммунореактивных нейронов изучали в чувствительных узлах блуждающего и грудного спинномозгового нервов у крыс 3-, 10-, 20-, 30-, 60-, 90- и 180-дневных возрастов в условиях химической деафферентации. Результаты показали, что нейроны, содержащие кальцитонин ген родственный пептид выявлялись с момента рождения крысы в обоих узлах, количество которых с возрастом уменьшалось. Большая часть КГРП-иммунореактивных нейронов имела малые размеры (до 600 мкм2). Введение капсаицина изменяло возрастную динамику КГРП-им-мунопозитивных нейронов, что проявлялось в уменьшении средней площади сечения клеток и значительном снижении их количества в узле грудного нерва, и в отсутствии выявляемости позитивных нейронов в узле блуждающего нерва.

Ключевые слова: нейрон, каудальный узел, спинномозговой узел, кальцитонин ген родственный пептид, капсаицин, онтогенез, крыса.

Изучение механизмов болевых ощущений ведется в течение многих десятилетий специалистами различного профиля, исследования которых свидетельствуют, что болевая чувствительность обеспечивается несколькими типами ноцицепто-ров — механо-молчащими, полимодальными, специфическими тепловыми, холодовыми. Перед нейробиологами стоит задача выявления специфичности восприятия болевых ощущений, сущность которых может быть сведена к раскрытию ионных каналов из семейства TRP-каналов (ТРП, транзиторный рецепторный потенциал). Наиболее известными представителями этой группы являются TRPV1 (ваниллоидные), чувствительные к капсаицину, теплу и низкому значению рН.

Установлено, что рецепторы капсаицина локализуются в С-волокнах и их ветвлениях, образованных нейронами чувствительных узлов, сигнализирующих о боли (Piper et al., 2000; Ma, 2002). Активация капсаицин-чувствительных термина-лей заключается в повышении проводимости неселективных катионных каналов (Szolcsamyi, 2004; Bucelli et al., 2008; Спиридонов и др., 2010), что приводит к усилению выделения вещества Р (substance P) и кальцитонин ген родственного пептида (calcitonin gene-related peptide).

Настоящее исследование имеет цель выявить возрастные изменения характеристик нейронов, содержащих кальцитонин ген-родственный пеп-

тид в чувствительных узлах блуждающего и спинномозгового нервов на фоне дефицита афферен-тации , вызванной капсаицином.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

Исследование проведено на 70 белых крысах-самках линии Вистар в возрасте 3, 10, 20, 30, 60, 90 и 180 суток после рождения с соблюдением "Правил проведения работ с использованием экспериментальных животных" (приказ № 775 от 12.08.1977 г. МЗ СССР). Животные были разделены на две группы: контрольная (n = 35), опытная (n = 35). В опытной группе на вторые сутки жизни крыс моделировали деафферентацию путем однократного подкожного введения капсаицина (N-vanillylonanamide, Sigma) 150 мг/кг в растворе, состоящем из 1 части 96% этилового спирта, 1 части Твин-80, 8 частей 0.9% раствора NaCl. Мор-фометрические характеристики нейронов, содержащих кальцитонин ген родственный пептид (КГРП) изучали в каудальном узле (нижний узел) блуждающего нерва (КУБН) и в чувствительном узле второго грудного спинномозгового нерва (ЧУГН). Эвтаназию животных осуществляли под уретановым наркозом (3 г/кг, внутрибрюшинно) путем транскардиальной перфузии физиологического раствора с гепарином (5 Ед/л), затем 4% раствора параформальдегда на 0.1 М фосфатном буфере. Выделенные узлы фиксировали в течение

Таблица 1. Относительное содержание КГРП-иммунореактивных нейронов в контроле и при химической деаф-ферентации капсаицином (х ± ях)

Возраст (сутки) ^БН ЧУГН

контроль опыт контроль опыт

3 20. ± 1.42 15.4 ± 1.48** 12.8 ± 0.б2 10.5 ± 1.59**

10 14.б ± 1.34* - 29.2 ± 1.48* 9.б ± 0.84**

20 7.3 ± 1.29* - 27.3 ± 1.75* 7.5 ± 0.17*,**

30 б.4 ± 1.18* - 27.9 ± 1.63* 8.5 ± 0.31**

б0 7.0 ± 1.22* - 27.б ± Об* 7.2 ± 0.24*,**

90 б.б ± 1.20* - 2б.З ± 1.45* 7.6 ± 0.22*,**

180 7.1 ± 1.17* - 27.2 ± 1.б4* 7.4 ± 0.16*,**

*р < 0.05, различия достоверны по сравнению с 3-суточным крысенком; **р < 0.05, различия достоверны по сравнению с контрольной группой.

2 часов в предыдущей смеси, после чего промывали трехкратно в физиологическом растворе на фосфатном буфере (PBS) в течение 30 минут и оставляли в 30% растворе сахарозы на 24 часа. Из фиксированного материала на криостате готовили срезы толщиной 20 мкм.

Выявление нейронов, содержащих K^^ проводили при помощи меченых кроличьих антител Абкам (Abcam, Великобритания, разведение 1 : 1000), по методике описанной ранее (Masliukov et al., 2004; Маслюков и др., 2009). Вторичные антитела были конъюгированы с флюорохромом FITC (Jackson, США), дающим зеленую флюоресценцию. Иммуногистохимиче-скую окраску срезов проводили одновременно в контрольной и опытной группах. Для расчета процента иммунореактивных нейронов кроме меток к K^^ производили мечение всей нейронной популяции при помощи флюорохрома Neuro Trace (Molecular Probes, США) с красной флюоресценцией.

Анализ препаратов проводили на флюоресцентном микроскопе ЛОМО Микмед 2, вариант 12 Россия, Санкт-Петербург) с соответствующим набором светофильтров и CCD камеры ScopeTec MDC320 (Km^). На цифровых изображениях гистологических препаратов узлов при увеличении x200 по программе Image J (NIH, США) определяли площадь сечения нервных клеток с помощью квадратно-сетчатой вставки и проводили подсчет клеток на площади квадрата 100 мкм2. Долю иммунореактивных нейронов определяли как их отношение к общему числу нейронов, которое принимали за 100%. Для характеристики нейронов узлов по площади сечения использовали 5 размерных классов: до 300 мкм2 (очень малые), 301—б00 мкм2 (малые), б01— 900 мкм2 (средние), 901—1200 мкм2 (крупные), 1201—1500 мкм2 (очень крупные). Анализу подлежали нервные клетки, срез которых прошел через

ядро с ядрышком, флюоресценция превышала фоновое свечение среза. Статистический анализ включал определение средней арифметической и ее стандартной ошибки. О значимости различий судили по величине ¿-критерия Стьюдента и считали их достоверными при Р < 0.05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В контрольной группе животных в обоих чувствительных узлах выявлялись КГРП-иммуноре-активные нейроны во всех исследуемых возрастах крысы (рис. 1). При этом большинство КГРП-иммунореактивных нейронов на срезе узлов было представлено клетками малых и средних размеров, выявлялись единичные клетки крупного размера. Вся популяция КГРП-содержащих нейронов имела зеленую флюоресценцию, интенсивность которой менялась с возрастом животного. Так, в 3- и 10-дневных возрастах крысы нейро-плазма КГРП-иммунореактивных нейронов обладала ярким изумрудным свечением, в последующих возрастах интенсивность люминесценции уменьшилась до зеленого цвета. По распределению продукта реакции в цитоплазме клетки, всю популяцию КГРП-позитивных нейронов можно разделить на две субпопуляции клеток: меньшую, представленную нейроны малых размеров с диффузной интенсивной флюоресценцией; большую, состоящую из нейронов, в цитоплазме которых флюоресценцией обладали гранулы в виде зернистых включений. Во всех возрастах крыс на срезе обоих узлов отчетливо выявлялись флюоресцирующие волокна.

Подсчет нейронов показал (табл. 1), что количество КГРП-иммунореактивных нейронов в КУБН в 3-дневном возрасте было максимальным. Относительное содержание позитивных нейронов в узле в 10-дневном возрасте снизилось в 1.4 раза и в 20-дневном возрасте — в 2.7 раза по сравнению с 3-дневным возрастом крысы. В по-

Таблица 2. Средняя площадь сечения КГРП-иммунореактивных нейронов в контроле и при химической деаф-ферентации капсаицином (х ± 5х, мкм2)

Возраст (сутки) КУБН ЧУГН

контроль опыт контроль опыт

3 349.2 ± 15.02 320.9 ± 14.67 321.6 ± 12.73 312.7 ± 13.85

10 419.5 ± 14.62* - 303.8 ± 9.39 287.8 ± 12.20*

20 501.1 ± 43.78* - 356.4 ± 12.33* 264.7 ± 12.09*

30 657.4 ± 34.15* - 373.8 ± 18.74* 290.3 ± 12.35*,**

60 629.1 ± 15.73* - 401.2 ± 14.12* 322.5 ± 9.17**

90 623.3 ± 33.97* - 462.7 ± 23.09* 348.6 ± 22.42**

180 613.3 ± 16.97* - 534.3 ± 25.98* 591.5 ± 23.37*,**

*р < 0.05, различия достоверны по сравнению с 3-суточным крысенком; **р < 0.05, различия достоверны по сравнению с контрольной группой.

следующих возрастах до конца наблюдения количество позитивных нейронов значимо не менялось. Количество КГРП-иммунореактивных нейронов в ЧУГН в 3-дневном возрасте было минимальным, в 10-дневном возрасте увеличилось в 2.1 раза по отношению к 3-дневному возрасту, незначительно снизилось в 20-дневном возрасте и оставалось, не меняясь, до шести месяцев жизни.

Т.о., количественный состав популяции КГРП-иммунореактивных нейронов являлся различным для исследуемых чувствительных узлов, но становился стабильным с 20-дневного возраста и сохранялся до 180-дневного возраста крысы.

После введения капсаицина в опытной группе животных выявлялись КГРП-иммунореактивные нейроны только в 3-дневном возрасте крысы в КУБН и во всех исследуемых возрастах крысы в ЧУГН (табл. 1). Возрастная динамика количества КГРП-иммунореактивных нейронов в ЧУГН в опытной группе характеризовалась значимым снижением числа иммунопозитивных нейронов в 20-дневном возрасте по отношению к 3-дневному возрасту. В последующем, до конца исследования, количество КГРП-иммунореактивных нейронов в ЧУГН в опытной группе практически не менялось. Однако существенным являлось выраженное снижение по сравнению с контролем числа КГРП-иммунореактивных нейронов в ЧУГН во всех возрастных группах. Так, после введения капсаицина, в 3-дневном возрасте крысы количество позитивных нейронов в ЧУГН было меньше, чем в контроле в

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком