ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК, 2007, том 414, № 2, с. 277-279
КЛЕТОЧНАЯ ^^^^^^^^^^^^^^^^ БИОЛОГИЯ
УДК. 612.036.576.314.547.915.5.
ВВЕДЕНИЕ ЦИТОТОКСИЧЕСКОГО КОМПЛЕКСА Tag7-Hsp70 МЫШАМ С ТРАНСПЛАНТИРОВАННЫМИ ОПУХОЛЯМИ ТОРМОЗИТ РОСТ ОПУХОЛИ
© 2007 г. Е. А. Духанина, Д. В. Яшин, Т. И. Лукьянова, Е. А. Романова, О. Д. Кабанова, Ю. В. Шаталов, Л. П. Сащенко, член-корреспондент РАН Н. В. Гнучев
Поступило 10.11.2006 г.
Tag7(PGRP-S) - белок, являющийся продуктом гена tag7, обнаруженного в нашей лаборатории 10 лет тому назад в геноме мыши [1-2], а также чуть позднее Кангом и сотр. у насекомых [3]. Tag7 считается представителем семейства пептидогли-канузнающих белков и компонентом врожденного иммунитета. Он обладает антимикробным действием как у млекопитающих, так и у насекомых [4-6].
Ранее мы показали, что Tag7 (PGRP-S) мыши и человека обладает не только антимикробной, но и антираковой активностью [7], лечение мелано-мы геном tag7 находится на второй стадии клинических испытаний [8].
Мы также ранее установили, что Tag7 вовлечен в один из механизмов цитотоксического действия лимфоцитов, а именно, при взаимодействии с опухолевыми клетками лимфоциты способны секре-тировать в зону контакта через аппарат Гольджи Tag7-Hsp70-комплекс, обладающий цитотоксиче-ским действием на опухолевые клетки [9].
Целью данной работы было сравнить цитоток-сическое действие Tag7-Hsp70-комплекса на линии опухолевых клеток in vitro с его действием на трансплантированные в мышах опухоли in vivo.
В данной работе мы продемонстрировали, что Tag7-Hsp70-комплекс лизирует опухолевые клетки in vitro и задерживает рост опухоли в мышах in vivo, в соответствии с их метастатическим потенциалом.
На первом этапе работы мы исследовали цито-токсическую активность Tag7-Hsp70-комплекса in vitro, используя в качестве мишеней линии опу-
Институт биологии гена Российской Академии наук, Москва Институт молекулярной биологии Российской Академии наук, Москва Университет Осло,
Центр медицинских исследований в России
холевых клеток с различным метастатическим потенциалом.
Tag7-Hsp70-комплекс получали, инкубируя r-Tag7 мыши с г-Шр70 человека при 37°С, как описано [9], цитотоксическую активность определяли подсчетом умерших клеток, окрашенных трипановым синим, как описано в [10].
При исследовании цитотоксического действия Tag7-Hsp70-комплекса на различные опухолевые клетки (табл. 1) оказалось, что комплекс способен вызывать гибель клеток лимфомы Jurkatt, клеток аденокарциномы CSML-O, линии миеломы №0/1, линии меланомы М3, но он был инертным по отношению к клеткам с высоким метастатическим потенциалом: клеткам аденокарциномы CSML-100, клеткам альвеолярной карциномы легких Line1, клеткам мышиной аденокарциномы молочной железы VMR-Liv.
Клетки CSML-0 Jurkatt обладают низким метастатическим потенциалом, они оказались наиболее чувствительными к действию Tag7-Hsp70-комплекса. Линии клеток миеломы и меланомы гетерогенны и содержат клетки как метастазиру-ющие, так и неметастазирующие, процент лизиса этих клеток снижается по сравнению с клетками CSML-0. Клетки с высоким метастатическим потенциалом полностью резистентны к действию комплекса, т.е. цитотоксичность комплекса проявляется при использовании в качестве мишеней опу-
Таблица 1. Цитотоксическое действие комплекса Tag7-Hsp70 на линии опухолевых клеток
Опухолевые клетки Цитотоксичность, %
CSML-0 33 ± 3
Jurkatt 27 ± 2.5
Меланома М3 20 ± 2
Миелома NSO/1 17 ± 2
CSML-100 2 ± 0.5
Line 1 1.5 ± 0.5
VMR-Liv 1.8 ± 0.5
278 ДУХАНИНА и др.
Таблица 2. Торможение роста опухоли (миелома №0/1) при введении цитотоксического комплекса Tag7-Hsp70
Препарат Инвазированные животные Умершие животные, 35-й день
15 день 35 день
число % число % число %
Контроль 4 80 4 80 4 80
Tag7-Hsp70 через 7 ч 1 20 4 80 2 40
Tag7-Hsp70 через 24 ч 1 20 4 80 1 20
Tag7-Hsp70 через 120 ч 1 20 4 80 2 40
Примечание. В каждой группе было по 5 мышей.
холевых клеток с относительно низким метастатическим потенциалом. Различная чувствительность опухолевых клеток к действию Та§7-№р70-ком-плекса может быть связана с их способностью избегать иммунного контроля. Эта проблема широко обсуждается в литературе [11, 12]. Для метастатических клеток описан наиболее радикальный способ иммуноэвазии, когда клетки полностью теряют поверхностные антигены и рецепторы, препятствуя таким образом узнаванию этих клеток цитотокси-ческими лимфоцитами и цитотоксическими агентами [13].
Далее мышам прививали опухолевые клетки, вводили Та§7-Шр70 комплекс и анализировали
Размер опухоли, мм 25
20
15
10
5
14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 ^г (б)
20 15 10
1
✓K-f-M
12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40
Время, дни
Рис. 1. Рост опухоли меланомы М3 при введении комплекса Tag7-Hsp70. а - мышам вводили рекомбинант-ный комплекс Tag7-Hsp70. б - мышам вводили естественный комплекс Tag7-Hsp70. Контрольным группам мышей вводили физраствор. 1 - контроль, 2 -опыт. Данные усреднены по 8 животным.
рост опухоли у контрольных мышей и мышей с введенным цитотоксическим комплексом.
Для введения опухолевой линии миеломы NSO/1 мышам BALB/c проводили однократную внутрибрюшинную инъекцию суспензии опухолевых клеток в дозе 2.5 ■ 106 клеток/мышь. Препарат Tag7-Hsp70-комплекс вводили внутрипери-тонеально через 7, 24 и 120 ч после введения опухолевых клеток в дозе 1 мкг/100 мкл на мышь. Введение препарата проводили 1 раз в день в течение 7 дней. В группах контрольных и инъецированных животных определяли количество ин-вазированных и погибших животных через 15 и 35 дней после введения опухолевых клеток. Результаты приведены в табл. 2.
Можно видеть, что на 15-й день в группе, получавшей цитотоксический препарат, число инвази-рованных животных меньше, чем в контрольной группе. Однако на 35-й день эти значения в контрольной группе и группе, получавшей цитотоксический препарат, сравнялись. В то же время в контрольной группе процент погибших животных значительно выше. Эти результаты свидетельствуют о том, что введение препарата оказывает задержку в росте опухоли.
Далее мы вводили мышам линию меланомы М3 и в течение 35 дней измеряли опухоли в группах контрольных мышей и мышей, получивших препарат Tag7-Hsp70. Экспериментальным мышам линии DBA прививали подкожно на внутреннюю поверхность бедра опухолевые клетки в дозе 2 ■ 106 клеток/мышь. Через 6 дней после введения опухоли вводили подкожно препарат Tag7-Hsp70 в дозе 0.01 мкг/100 мкл на мышь. Опухоль измеряли через 3 дня. Усредненные результаты приведены на рис. 1а. Можно видеть, что увеличение опухоли в группе мышей, получавших Tag7-Hsp70-комплекс, идет медленнее по сравнению с группой контрольных мышей. Однако на 30-й день после введения опухоли размеры опухоли в опытной группе достигали контрольных.
Неполное торможение роста опухоли можно объяснить двумя причинами. Во-первых, при введении комплекса Tag7-Hsp70, составленного из
ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК том 414 < 2 2007
ВВЕДЕНИЕ ЦИТОТОКСИЧЕСКОГО КОМПЛЕКСА Tag7-Hsp70 МЫШАМ 279
рекомбинантных белков, в организме мыши могут вырабатываться антитела к белкам этого комплекса, блокирующие цитотоксическое действие комплекса. Во-вторых, клетки, способные к метастазированию, могут проявлять резистентность к действию комплекса.
Для проверки первого предположения был получен естественный Tag7-Hsp70. С этой целью асептически извлеченные селезенки мышей DBA гомогенизировали и клетки суспендировали в концентрации 4 • 106 кл/мл в среде RPMI-1640 ("Gibco"), содержащей 20% ТЭС ("Gibco"). Макрофаги и В-лимфоциты удаляли с использованием магнитных шариков, связанных с антителами. Лимфоциты культивировали в течение 6 сут, добавляя интерлейкин-2 (100 ед./мл). Для индукции секреции белков лимфоциты инкубировали с клетками К562 (100:1) в бессывороточной куль-туральной среде 18 ч при 37°С. Клетки удаляли центрифугированием, а супернатант очищали с использованием аффинной хроматографии. Для выделения цитотоксического комплекса супернатант пропускали через сефарозу с иммобилизованными антителами к Tag7. Сопутствующие белки удаляли промыванием сефарозы 5-кратным объемом фосфатно-солевого буфера с 0.5 М NaCl. Связавшийся Tag7-Hsp70-комплекс элюи-ровали раствором 0.25 М триэтиламина, высушивали в вакууме и растворяли в физиологическом растворе.
Экспериментальным мышам DBA прививали опухолевые клетки, как описано выше. Через 6 дней опытной группе мышей вводили подкожно комплекс Tag7-Hsp70 в дозе 0.01 мкг/100 мкл на мышь. Введение препарата повторяли каждые 3 дня, проводя замеры опухоли. Усредненные результаты приведены на рис. 16. Можно видеть, что действие естественного комплекса Tag7-Hsp70 практически не отличается от действия ре-комбинантного комплекса. Развитие опухоли тормозится в течение 35 дней, затем размеры опухоли приближаются к размерам в группе контрольных
животных. Можно предположить, что рост опухоли усиливается из-за резистентности метастатических клеток к действию Tag7-Hsp70-комплекса.
Таким образом, мы продемонстрировали полную корреляцию между цитотоксическим действием Tag7-Hsp70-комплекса на опухолевые клетки in vitro и его действием на рост опухоли in vivo. В сочетании с веществами, подавляющими метастазирование, Tag7-Hsp70-комплекс может быть использован при лечении опухолевой прогрессии.
Работа была поддержана "Московской антираковой программой", грантом РФФИ 05-04-48832, программой "Молекулярная и клеточная биология", Международным центром генетической инженерии и биотехнологии (грант CRP/RUS 05-01).
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Кустикова ОС, Киселев С.Л., Бородулина О.Р. и др. // Генетика. 1996. № 32. С. 621-628.
2. Kiselev S.L., Kustikova OS, Korobko E.V. et al. // J. Biol. Chem. 1998. V. 273. P. 18633-18639.
3. Kang D, Liu G, Lundstrom A. et al. // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1998. V. 95. P. 10078-10082.
4. Dziarski R. // Mol. Immunol. 2004. V. 40. P. 877-886.
5. Michel T, Reichhart JM, Hoffmann J.A. et al. // Nature. 2001. V. 414. P. 756-759.
6. Liu C, Xu Z, Gupta D. et al. // J. Biol. Chem. 2001. V. 276. P. 34686-34694.
7. Larin S.S., Georgiev G.P., Kiselev S.L. // Ge
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.