ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 579.26
ВЫДЕЛЕНИЕ БАКТЕРИЙ РОДА VARIOVORAX ИЗ МАТОВ THIOPLOCA ОЗЕРА БАЙКАЛ © 2012 г. Н. М. Дульцева*, 1, С. М. Черницына**, Т. И. Земская**
* Учреждение Российской академии наук Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН, Москва
** Лимнологический институт СО РАН, Иркутск Поступила в редакцию 09.03.2011 г.
Из проб матов бесцветных серобактерий рода Thioploca (оз. Байкал) выделено три штамма грамот-рицательных бактерий. Клетки новых штаммов подвижные, с перитрихальным жгутикованием. Микроорганизмы являются аэробами, облигатными хемоорганогетеротрофами, растущими в пределах значений pH 3.0—8.8 с оптимумом при pH 8.3 и при температурах от 5 до 42°С с оптимумом при 28°C. Клетки содержат в основном менахинон МК-8 H2 и в незначительных количествах (менее 15%) МК-7 H2, убихинона Q8 как минимум на порядок меньше. Содержание Г + Ц в ДНК у новых штаммов составляет от 67.4 до 69.9 мол. %. Уровень гибридизации ДНК между ними — от 80 до 94%, и, таким образом, все изоляты относятся к одному виду. Анализ нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК типового штамма (GenBank HQ400611) показал наличие близких гомологов среди известных видов рода Variovorax: 98% сходства с типовыми штаммами видов V. paradoxus, V. soli, V. ginsengisoli, V. boronicumulans и 96% сходства с типовым штаммом V. dokdonensis. В то же время выделенные штаммы существенно отличаются от ближайших соседей на филогенетическом дереве по составу жирных кислот и изопреноидных хинонов, что не позволяет безоговорочно отнести их к ранее известным видам.
Ключевые слова: бухта Фролиха, озеро Байкал, маты бесцветных серобактерий рода ТЫор1оса, бактерии рода Уапоуогах, филогения.
Бесцветные серные бактерии рода Thioploca обитают как в морских, так и пресноводных экосистемах, и имеют уникальный метаболизм. Активно мигрируя между глубинным, богатым сульфидом осадком, и поверхностным слоем, богатым нитратом, Thioploca spp. связывают окисление сульфида с восстановлением нитрата [1, 2].
Несмотря на свои большие размеры, эти бактерии до сих пор остаются мало изученной группой микроорганизмов. Основная проблема, затрудняющая более подробное исследование видов рода Thioploca, — это отсутствие чистых культур. Выделение чистых культур невозможно без знания условий существования Thioploca spp. в природных экосистемах и особенностей метаболизма бактерий, находящихся с ними в ассоциации.
Бесцветные серобактерии рода Thioploca обнаружены в озере Байкал [3]. Было изучено видовое разнообразие и экофизиология этих бактерий и показано, что местообитание микробных матов Thioploca spp. характеризуется обилием растительных остатков и постоянным подтоком гидротермальных подземных вод необычного состава.
1 Автор для корреспонденции (e-mail: dultseva@mail.ru).
В матах ТМор1оса обнаружены тионовые, метан-окисляющие и сульфатвосстанавливающие бактерии [4].
Общий чехол — важная структура у представителей рода ТЫор1оса, имеющая большое экологическое значение. Предполагается, что органический материал, составляющий чехол, является запасным субстратом [5].
Известен ряд работ, посвященных ассоциации ТЫор1оса Брр. с другими бактериями [1, 5—10]. Наибольшее число из этих публикаций посвящено изучению бактерий, ассоциированных с чехлом морских видов ТНюр1оса [1, 6—8], однако имеются единичные сообщения о видах, обитающих в пресных или слабо соленых водах [5]. Так, показан симбиоз бактерий рода ТНюр1оса 8рр. с суль-фатредуктором Вези/опеша 8р. и с литотрофными бактериями, сходными с Апаттох [6]. Нитчатые сульфатвосстанавливающие бактерии (СВБ) рода Вези/опеша часто прикреплены к чехлу ТНюр1оса [5, 7]. Чехлы серобактерий ТЫор1оса являются запасным субстратом для СВБ и способствуют их перемещению вместе с чехлом. Бактерии Ве-зи/опеша 8рр. вместе с ТЫор1оса 8рр. находят свое оптимальное положение внутри донных осадков,
где сосредоточены доступные сульфаты и промежуточные соединения восстановленной серы [1]. Бактерии рода Thioploca, кроме того, получают органические вещества в качестве источника углерода и сульфид как энергетический субстрат, что очень важно в глубинных слоях, где концентрации его низки [1].
Литотрофные бактерии группы апаттох часто ассоциированы с Thioploca 8рр. Симбиотиче-ские отношения между Thioploca и бактериями, осуществляющими анаэробное окисление метана (апаттох), подтверждены геохимическими данными и результатами аналитического моделирования [6, 9, 10]. Также из мата Thioploca 8рр. (осадок континентального шельфа Чили) выделена хемолитоавтотрофная сероокисляющая бактерия Thiomicrospira chilensis 8р. поу. [10]. В бактериальных сообществах, ассоциированных с чехлами Thioploca Брр. из пресноводных озер Бива (Япония) и Констанс (Германия) и солоноватого озера Огавара (Япония), обнаружены органотрофные бактерии типа Bacteroidetes, кластер Desulforho-palus/Desulfobulbus. Предполагается, что они могут использовать материал чехла тиоплоки в качестве субстрата роста [5].
Все перечисленные примеры касаются организмов, ассоциированных с внешней поверхностью чехлов Thioploca. Данных о бактериях, обитающих внутри чехлов Thioploca, нет.
Цель настоящей работы состояла в выделении и характеристике бактерий, находящихся внутри чехлов байкальских пресноводных Thioploca 8рр.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Источник выделения и методы культивировани-
ия. Пробы донных осадков озера Байкал (бухта Фролиха) были отобраны в конце августа—начале сентября 2003 г. с использованием пробоотборников (дночерпатель "Океан", бентосная трубка) во время экспедиций на НИС "Верещагин" с глубины 430 м, из мест, где наблюдали массовый рост бесцветных серобактерий рода Thioploca. Время отбора проб соответствовало периоду их массового развития. Маты Thioploca легко определялись визуально, образовывали большие скопления бактерий в поверхностных слоях осадков. Чехлы с белоснежными трихомами были сильно инкрустированы солями железа и покрыты многочисленными бактериальными обрастаниями. Длина нитей иногда достигала 2 см.
Концентрацию сульфида, кислорода и бикарбоната определяли согласно стандартным методикам [11]. Температуру, величины рН и ЕЙ измеряли с помощью портативных приборов: сенсорно-
го электротермометра Prima (Сингапур), рН-метра PRO (Сингапур), измерителя редокс-потенциала ORP (Португалия).
Перед посевом, под лупой запаянным концом пастеровской пипетки соскабливали имеющиеся на чехле обрастания. Чехлы промывали в стерильной байкальской воде, нанесенной в виде капель на чашки Петри. Далее острым концом пастеровской пипетки осторожно вскрывали чехол, высвобождали из него нити и тщательно промывали их запаянным концом пастеровской пипетки в стерильной байкальской воде. Отмывание проводили быстро, чтобы был минимальный по времени контакт с воздухом. Для посева брали связки нитей, так как в чехлах они переплетены. Затем помещали по 10 трихомов Thioploca в пробирки со средой.
Для получения накопительных культур бактерий использовалась среда следующего состава, основу которой составляет среда для Macromonas [12], (г/л): NaNO3 - 0.1; CaCl2 - 0.1; ацетат Na - 1; кислый гидролизат казеина — 0.1; дрожжевой экстракт Дифко — 0.1; сброженный ил — 1 мл; агар Дифко - 1; раствор витаминов и микроэлементов по Пфеннигу [13] — 1 мл; вода дистиллированная — 1 л. Исходное значение pH 8.1 устанавливали добавлением 10%-ного раствора NaHCO3. Среду разливали по пробиркам, на дно которых помещали 0.2 г FeS. Для выделения штаммов использовали ту же агаризованную среду (14 г/л агара) в чашках Петри.
Морфо-физиологические характеристики. Морфологию культур исследовали под светооптиче-ским микроскопом фирмы "Carl Zeiss" (ГДР) с фазово-контрастным устройством. Размеры живых бактериальных клеток определяли с помощью окуляр-микрометра. Тонкое строение клеток исследовали на ультратонких срезах в электронном микроскопе марки JEM-100 ("JEOL", Япония) при ускоряющем напряжении 80 кВ [14, 15].
Способность бактерий использовать различные соединения серы в качестве доноров электронов проверяли на жидкой среде следующего состава (г/л): NH4Cl — 0.1; CaCl2 — 0.1; K2HPO4 — 0.022; KH2PO4 — 0.017; ацетат и лактат Na — 0.1; D-глюкоза — 0. 2; раствор витаминов и микроэлементов по Пфеннигу [13] — 1 мл; вода дистиллированная — 1 л. Исходное значение pH 8.1 устанавливали добавлением 10% раствора NaHCO3. В среду вносили в концентрации 0.03% одно из испытуемых серных соединений: тиосульфат, сульфид, сульфит и сульфат (в качестве контроля).
Потребление восстановленных неорганических соединений серы определяли методом раздельного иодометрического титрования [16].
Способность бактерий к использованию различных источников азота проверяли на жидкой среде указанного выше состава c добавлением Na2S2O3 • 5 H2O — 1 г/л. Источник азота вносили в среду в концентрации 0.01%.
Использование бактериями различных источников углерода проверяли на минеральной среде, содержащей источник углерода в концентрации 0.05%. Культивирование проводили в чашках Петри. Среды были агаризованы в виду нестабильного роста на жидкой среде, использовали отмытый агар фирмы "Дифко" (14 г/л). Рост бактерий определяли по числу колоний на чашках при 10-кратных разведениях.
Результаты экспериментов анализировали после трех последовательных пересевов на среде с одним и тем же источником. Численность клеток бактерий в препаратах подсчитывали при использовании фазово-контрастного устройства. Рост бактерий оценивали по белку с использованием красителя кумаси синего [17].
Способность культур к окислению водорода изучали, используя флаконы объемом 30 мл. Флакон заполняли газовой смесью, состоящей из 80% H2, 10% CO2 и 10% O2, вносили шприцем посевной материал — 2-сут. культуру (10% от объема засеваемой среды). Затем флаконы переворачивали. В качестве контролей использованы флаконы смеси газов со средой без посевного материала.
Устойчивость штаммов к антибиотикам проверяли, используя агаризованную среду указанного выше состава. Тест-диски с различными антибиотиками помещали на газоны культуры в следующих концентрациях (мкг): новобиоцин, рифампи-ци
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.