ПОЧВОВЕДЕНИЕ, 2014, № 12, с. 1490-1497
БИОЛОГИЯ ПОЧВ
УДК 631.4
ВЫДЕЛЕНИЕ И ИДЕНТИФИКАЦИЯ ЖЕЛЕЗОВОССТАНАВЛИВАЮЩИХ БАКТЕРИЙ И ОЦЕНКА ИХ РОЛИ В ДОСТУПНОСТИ ЖЕЛЕЗА
В КАРБОНАТНЫХ ПОЧВАХ
© 2014 г. Н. Гхорбанзадех, А. Лакзиан, Г. Х. Хагхниа, А. Р. Карими
Сельскохозяйственный колледж, Фирдоуси университет Мешхед, Иран e-mail: nasrin_gh908@yahoo.com Поступила в редакцию 18.10.2013 г.
Выделены и идентифицированы бактериальные изоляты, оценена их способности восстанавливать Fe(III) в двух карбонатных рисовых почвах. Из этих почв отобрали и идентифицировали три бактериальных изолята путем анализа продуктов амплификации генов 16S рДНК, с последующим посевом на стерильные и нестерильные почвенные среды в присутствии и отсутствии глюкозы. Выявили способность изолятов рода Bacillus восстанавливать Fe(III) до Fe(II) в условиях in vitro. Количество восстановленного железа в стерильных карбонатных почвенных средах было значительно больше при посеве изолята PS23 и Shewanella putrefaciens (для положительного контроля среды) по сравнению с изолятами PS16 и PS11. В опытах выявили существенное влияние глюкозы на активность восстановления Fe(III). В нестерильных почвенных средах количество восстановленного Fe(III) увеличивалось вдвое при обработке глюкозой с посевами S. putrefaciens и PS23.
Ключевые слова: биогенное восстановление, Bacillus sp., трехвалентное железо, рисовые почвы, Shewanella putrefaciens.
Б01: 10.7868/80032180X14120053
ВВЕДЕНИЕ
Железо является четвертым по количественному содержанию элементом земной коры [34] и физиологически необходимым элементом для всех живых организмов. Оно играет ключевую роль в основных биохимических реакциях, в частности, при транспорте электронов в ходе дыхания и фотосинтеза [27]. Оно задействовано в синтезе хлорофилла, поддерживая структуру и функционирование хлоропластов. Изменение валентности при переходе от Ре(Ш) к БеЩ) является важным условием протекания внутриклеточных окислительно-восстановительных процессов [27]. Несмотря на обилие железа во многих почвах, его доступность растениям часто ограничена, поскольку в аэробных условиях оно часто представлено в трехвалентной формой в составе малорастворимых минеральных компонентов [22, 29, 31]. Дефицит железа в растительных тканях приводит к нарушениям в биосинтезе хлорофилла и развитии хлоропластов [9], поэтому продуктивность растений напрямую связана с доступностью железа. Хлороз растительных культур, возникающий из-за дефицита железа на щелочных карбонатных почвах, является причиной снижения урожайности на почти 30% сельскохозяйственных угодий мира [9]. Растения поглощают железо двумя различными способами. Незерно-
вые культуры продуцируют протоны хелатредук-тазы, которые растворяют Fe(III), переводя его в Fe(II), то есть доступную для растений форму [9, 11, 27]. Другой способ основан на высвобождении вторичных аминокислот с небольшой молекулярной массой, известных как "фитосидерофоры" и способных хелатировать железо [6]. Сидерофоры синтезируются спектром микроорганизмов [5], которые увеличивают доступность железа для растений [27]. Кроме того, в анаэробных условиях при отсутствии других акцепторов электронов некоторые бактерии родов Geobacter и Shewanella могут устанавливать связь между окислением органического вещества и восстановлением трехвалентного железа. Этот биогенный процесс известен как диссимиляционное восстановление металлов (DMR — dissimilatory metal reduction) [23, 33]. К настоящему времени выделено и описано несколько типов железовосстанавливающих микроорганизмов из различных местообитаний [19, 32]. В сельскохозяйственных земелях содержится до 105 кл./г почвы железовосстанавливающих бактерий [12]. В нейтральных и щелочных средах карбонатных почв железо представлено малорастворимыми соединениями Fe(III), для преобразования которых в доступную для растений форму Fe(II) необходимо присутствие бактериальных штаммов с высокой железовосстановли-
Таблица 1. Краткая физико-химическая характеристика изученных почв
Почва ПВ* Пыль Ил Песок ЕКО С орг pH Fe-DTPA, Fe^-ВГ**,
% солевой мг/кг мг/г
A 14 40 17 42 16 0.77 7.64 1.7 27.11
B 11.2 32 16 52 7.63 0.25 7.62 2.7 22.63
* Полевая влагоемкость. ** Fe(III), восстановленное гидроксиламином.
вающей активностью [27]. Ранее изучены процессы восстановления трехвалентного железа в почвенных глинистых минералах и оксидах и гидроксидах [7, 24, 30], при этом недостаточно внимания было уделено почвенным бактериям, способным восстанавливать железо. Показано, что в щелочных почвах бактериальные популяции ризосферы способны восстанавливать Ре(Ш) с помощью гидроксиламина [27].
Настоящее исследование направлено на выделение и идентификацию железовосстанавливаю-щих бактерий и оценку их способности восстанавливать Ре(Ш) для решения проблемы дефицита железа в двух карбонатных почвах.
ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ
Отбор почвенных образцов. Образцы отобрали с глубины 0—15 см из двух рисовых почв (Инсептисолей) в провинции Гуйлан на севере Ирана, где среднегодовое количество осадков составляет 1186 мм, среднегодовая температура — 17.5°С. Из этих образцов выделяли железовосста-навливающие бактерии. Железовосстанавливаю-щую способность бактериальных изолятов определяли в двух карбонатных почвах из провинции Хорасан в восточном Иране, где среднегодовое количество осадков составляет 259.7 мм и среднегодовая температура — 13.7°С. Для этих карбонатных почв определяли физико-химический свойства (табл. 1), а также содержание хелатов железа, извлекаемых вытяжкой диэтилентриаминпента-уксусной кислоты (Бе-ДТПА), и содержание трехвалентного железа, восстанавливаемого гид-роксиламином, по соответствующим методам [14, 16].
Выделение бактериальных и з о л я -т о в. Суспензии почв в стерилизованной воде (1 : 10) помещали в инкубатор-шейкер при скорости 120 об./мин и температуре 25°С без доступа света на неделю для активирования сообщества железовосстанавливающих бактерий. Затем суспензии центрифугировали на скорости 700 об./мин в течение 10 мин. Из надосадочной жидкости готовили серии разбавлений различной кратности. Разбавления кратностью от 10-5 до 10-9 использовали для посевов на агаризован-
ные питательные среды с инкубацией при температуре 25°C без доступа света в течение недели. Затем получали случайную выборку 50-и морфологически различных бактериальных колоний, которые после очистки хранили при температуре —4°C.
Выделение целевых видов бактерий из колоний. Содержащиеся в 5 мл питательного бульона бактерии переносили в буфер (20 мМ HEPES, 0.1 мМ феррозина и 400 мкмМ цитрата железа). Затем бактериальные суспензии (108 кл./мл) при помощи стерильного шприца ин-нокулировали в просушенные сосуды, предварительно обработанные N2 в течение 5 мин (для удаления O2) и закупоренные бутиловыми пробками. После трехдневной инкубации при температуре 30°C без доступа света на спектрофотометре измеряли количество восстановленного Fe(III), адсорбцию определяли при длине волны 562 нм.
Экстракция ДНК и пробоподго-товка для ПЦР-анализа. Из трех выбранных бактериальных изолятов с наилучшей способностью к восстановлению Fe(III) экстрагировали ДНК экспресс-методом [4]. Амплификацию генов 16S рДНК каждого бактериального изолята проводили с использованием двух праймеров: "fd1" (5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3') и "rd1" (5'-AAGGAGGTGATCCAGCC-3') [2, 3]. Для полимеразных цепных реакций (ПЦР) использовали стандартную смесь реагентов (100 мМ dNTPs, 10 мМ MgCl2, 15 мМ каждого праймера, 0.2U Taq-полимеразы и 1 нг матричной бактериальной ДНК). Негативный контроль содержал все компоненты для ПЦР, за исключением матричной ДНК. ПЦР-анализ проводили на приборе "DNA thermal cycler" для 35 циклов амплификации. После начальной денатурации смеси реагентов при температуре 95°C в течение 3 мин для каждого следующего цикла проводилась денатурация при 95°C в течение 1 мин и дальнейшие обработки при 63°C (1 мин) и 72°C (2 мин). В конечном цикле последняя обработка при температуре 72° C длилась 5 мин. Для разделения продуктов реакции использовали 2%-ный агарозный гель, содержащий 0.5 мкг/мл бромистого этидия, и визуализацию в ультрафиолетовом свете.
Секвенирование и филогенетический анализ. Выборка репрезентативных ПЦР ампликонов была представлена для клонирования и секвенирования в лаборатории "Takapoozis Company" (http://www.takapouzist.com). Полученные амплификаты заносили в базу данных "Gen Bank NCBI" (www.ncbi.nlm.nih.gov/blast) для проведения сравнительного анализа на основе сопоставления с существующими секвенциями с использованием компьютерной программы "BLAST".
Селекция железов осстанавлива-ющих бактерий. Бактерия S. putrefaciens является факультативным анаэробом, способным окислять органическое вещество в бескислородных условиях [7]. Штамм этих бактерий получили из микробиологического банка Ирана (Центральная коллекция промышленных грибов и бактерий, Иран-Карадж). Данный штамм S. putrefaciens хранили в банке в 40%-ном глицероле при температуре —80°C и затем размножали по стандартной технологии в аэробной среде на триптонсоевом бульоне (30 г/л). Изоляты PS23, PS16 и PS11 из рисовых почв отобрали для экспериментов по восстановлению трехвалентного железа.
Бактериальные культуры. Штамм S. putrefaciens и три изолята Bacillus выращивали в аэробных средах на триптонсоевом и питательном бульонах, соответственно, при перемешивании в шейкере (110 об./мин, 30°C). Культуры клеток осаждали путем центрифугирования в течение 10 мин, трижды промывали стерилизованной водой и переводили в суспензию в стерилизованной воде.
Постановка эксперимента. Эксперимент ставили по полностью рандомизированной схеме в трех повторностях для тестирования способностей S. putrefaciens и изолятов Bacillus к восстановлению трехвалентного железа в лабораторных условиях. Посев изолятов проводили на стерильные и нестерильные образцы карбонатных почв в присутствии и отсутствии глюкозы (10 мг). В целом представлено 20 экспериментальных обработок, включая образцы без посева (контроль). После обработки образцы массой 5 г помещали в просушенные в печи колбы. Затем в эти колбы ин
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.