БИОХИМИЯ, 2009, том 74, вып. 1, с. 70 - 77
УДК 577.218
ВЫДЕЛЕНИЕ И КРИСТАЛЛИЗАЦИЯ ГЕТЕРОТРИМЕРНОГО ФАКТОРА ИНИЦИАЦИИ ТРАНСЛЯЦИИ 2 ИЗ Ш/оЫи® 8о1/Миткж*
© 2009 г. Е.А. Столбоушкина**, О.С. Никонов, М.Б. Гарбер
Институт белка РАН, 142290 Пущино Московской обл., ул. Институтская, 4; факс: 7(495)632-7871, электронная почта: esmail@vega.protres.ru
Поступила в редакцию 27.03.08 После доработки 17.04.08
Структура полного гетеротримерного фактора инициации трансляции 2 эукариотического типа (е/а№2) представляет большой интерес в связи с его ключевой ролью в доставке инициаторной тРНК на рибосому и в регуляции инициации трансляции у эукариот и архей. В качестве объекта для кристаллизации и структурных исследований выбран аШ2 из гипертермофильной архебактерии Би1/о1оЬш..о^апеш ^оШ2). Клонированы и суперэкспрессированы гены а-, Р-, у-субъединиц 88о№2. Предложен метод получения гомогенного гетеротримера 88о№2аРу. Впервые получены высокоупорядоченные кристаллы полноразмерного 88о№2, отражающие рентгеновские лучи с разрешением до 2,8 А.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: инициация трансляции, е/а№2, гетеротример, Би1/о1оЬш .о^апеш, кристаллы
В процессе инициации синтеза полипептидной цепи на рибосоме ключевую роль играет белковый фактор инициации трансляции 2 (1Б2). Фактор инициации трансляции 2 в комплексе с ОТР доставляет инициаторную метио-нил-тРНК (у бактерий это формил-метионил-тРНК) в Р-участок малой рибосомной субчастицы. У бактерий 1Б2 — крупный шестидоменный мономерный белок. В клетке он существует в виде трех функционально активных изоформ с молекулярной массой от 80 до 100 кДа. В настоящее время известны структуры лишь некоторых доменов бактериального 1Б2 [1—4].
В клетках эукариот и архей аналогичную функцию выполняет гетеротримерный фактор инициации трансляции 2аРу (е1Б2 и а1Б2 соответственно). Эукариотический е1Б2 и архейный а1Б2 гомологичны между собой (40, 27 и 50% гомологии для а-, р- и у-субъединиц соответственно), но ни одна из субъединиц этих факторов не имеет гомологии с бактериальным 1Б2.
Принятые сокращения: ДТТ — 1,4-дитиотреитол, ИПТГ — изопропил-Р-В-тиогалактопиранозид, ММЭ-ПЭГ — монометиловый эфир полиэтиленгликоля, о.е. — оптическая единица.
* Первоначально английский вариант рукописи был опубликован на сайте «Biochemistry» (Moscow), Papers in Press, BM 08-112, 14.12.2008.
** Адресат для корреспонденции и запросов оттисков.
Функциональные исследования изолированных субъединиц е/а1Б2 показали, что у-субъ-единица образует ядро гетеротримера, взаимодействуя с а- и р-субъединицами, которые между собой не контактируют [5—7]. В изолированном состоянии у-субъединица в комплексе с ОТР связывает инициаторную метионил-тРНК (МетРНК^1), но значительно слабее, чем в составе полного фактора инициации трансляции 2. Показано, что у архей ау-димер связывает Ме^РНК^1 с тем же сродством, что и полный а1Б2 [6, 7]. а-Субъединица обладает РНК-связывающими свойствами [6] и, по-видимому, взаимодействуя напрямую с тРНК, стабилизирует комплекс у-субъединицы с Ме^РНК^1. Однако у эукариот за связывание с Ме1тРНК;Ме1 отвечает Ру-димер [8, 9], а основная функция а-субъединицы е1Б2 — регуляция инициации трансляции посредством ее специфического фосфорилирования/дефосфорилирования [10, 11]. Недавно в архебактерии Ругоеоееш НопкозНН была обнаружена система специфического фос-форилирования а-субъединицы а1Б2, аналогичная системе фосфорилирования а-субъединицы эукариотического фактора инициации трансляции 2 [12]. Вероятно, в археях а-субъединица а1Б2 также участвует в регуляции биосинтеза белка на стадии инициации.
Р-Субъединица архейного 1Б2 по размеру в 2 раза меньше по сравнению с р-субъединицей
эукариотического 1Р2 и гомологична только ее С-концевой части [13, 14]. ^-Концевая часть е1Р2р взаимодействует с двумя другими факторами инициации трансляции е1Р2В и е1Р5, которые необходимы для функционирования полного е1Р2 [15—17]. В археях ни гомологов, ни аналогов е1Р2В и е1Р5 обнаружено не было. Роль в-субъединицы архейного фактора инициации трансляции 2, как и С-концевой части эукариотической е1Р2р, до сих пор неясна. Однако есть основания полагать, что они участвуют в узнавании инициирующего кодона, вероятно взаимодействуя с мРНК [18].
Структура полного гетеротримерного фактора инициации трансляции 2 представляет большой интерес ввиду важности его функции. Структура этого гетеротримерного белка активно исследуется более 5 лет: уже известны структуры изолированных субъединиц [14, 19—25], межсубъединичных димеров ау [26] и Ру [27], а недавно была определена структура неполного гетеротримерного а1Р2, в котором первый и второй домены а-субъединицы были удалены из рекомбинантного белка [28]. До настоящего момента структура полноразмерного гетеротри-мерного фактора инициации трансляции 2 оставалась неизвестной, поскольку из-за высокой междоменной подвижности субъединиц не удавалось получить высокоупорядоченные крупные кристаллы этого объекта.
В качестве объекта выбран термостабильный архейный фактор инициации трансляции 2 из Sulfolobus solfataricus (88о1Р2). Описаны клонирование генов всех трех субъединиц 88о1Р2, получение штаммов-суперпродуцентов субъединиц, методика выделения гомогенного препарата гетеротримера 88о1Р2 и получение пригодных для рентгеноструктурного анализа кристаллов полноразмерного 88оТР2.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Материалы и реагенты. Все химические реактивы были произведены фирмами «Sigma» (США), «Serva» (Германия) и «Merck» (Германия). Использованы ферменты Vent-ДНК-поли-мераза, сайтспецифические эндонуклеазы рестрикции NdeI, NcoI, BamHI фирмы «СибЭнзим» (Россия), Т4-ДНК-лигаза фирмы «Fermentas» (Литва) и синтетические олигонуклеотиды-праймеры фирмы «Синтол» (Россия). Использованы также плазмиды pET11c, pET11d («Novagen», США), клетки Escherichia coli штаммов XL1-Blue, BL21(DE3) («Novagen»), C41(DE3) («Imaxio», Франция) и хроматографические носители S-сефароза, гепарин-сефароза, супер-
декс-200 фирмы «Pharmacia» (Швеция). Кроме того, использованы ИПТГ фирмы «Takara» (Япония) и ампициллин фирмы «Биохимик» (Россия).
Клонирование генов a-, ß-, у-субъединиц SsoIF2. Гены a-, ß-, у-субъединиц (sso_ a, sso_ß, sso_Y соответственно) амплифицировали с помощью ПЦР. Матрицей служили плазмидные ДНК, содержащие нуклеотидные последовательности генов этих субъединиц вместе с последовательностями для олигогистидиновых «хвостов» [7]. Использовали олигонуклеотиды-праймеры, содержащие на концах сайты узнавания для сайтспецифических эндонуклеаз рестрикции NcoI (Ndel в случае клонирования a-субъединицы) и BamHI. Прямые праймеры — F sso_a 5 -GGAATTCCATATGATTTACAGTAGAAG-CAAA-3', F sso_ß 5 -CATGCCATGGGTAGTTCGA-AAAAGAATAC-3', F sso_y 5-CATACCATGGCA-TGGCCTAAAGTTCAACC-3'; обратные - R sso_a 5-CGGGATCCTCATTTCTTAACCACACTTATA-3', R sso_ß 5-CGGGATCCTCATAGTGGTTTCACTG-GTGTT-3', R sso_Y 5-CGGGATCCTTAGATCTC-TACTAAACCCCATC-3'.
ПЦР проводили в 100 мкл. Реакционная смесь содержала 10 мкл 10-кратного ПЦР-буфе-ра (200 мМ Tris-HCl, pH 8,8, 100 мМ (NH4)2SO4, 20 мМ MgSO4, 100 мМ KCl и 1%-ный Triton X-100), смесь дезоксирибонуклеотидов (dATP, dCTP, dGTP и dTTP в концентрации 0,2 мМ каждый), праймеры (по 100 пмоль каждого), 20 нг плаз-мидной ДНК и 5 ед. активности Vent-ДНК-по-лимеразы. ДНК гена амплифицировали в течение 35 циклов. Каждый цикл состоял из трех этапов: денатурации ДНК при 95° в течение 30 с, отжига праймеров при 55° в течение 60 с, синтеза ДНК при 72° в течение 2 мин. Для завершения полного образования двуцепочечных структур -продуктов реакции ПЦР - реакционную смесь дополнительно прогревали 4 мин при 72°. Результаты реакции анализировали методом электрофореза в 1%-ном агарозном геле.
Плазмиду pET11d и очищенные с помощью фирменного набора QIAquick® PCR Purification Kit («Qiagen», США) амплифицированные гены ß- и у-субъединиц обрабатывали рестриктазами NcoI и BamHI. Плазмиду pET11c и ген a-субъ-единицы обрабатывали рестриктазами NdeI и BamHI. Полученные фрагменты очищали с помощью электрофореза с последующей элюцией из 1%-ной агарозы. Лигирование проводили в 20 мкл. Лигазная смесь содержала 50 нг вектора и 50 нг ПЦР-фрагмента. Клетки E. coli штамма XL1-Blue трансформировали лигазной смесью и высевали на агаризованную среду LB с ампициллином с концентрацией 100 мкг/мл. Из выросших колоний выделяли плазмидную ДНК и
анализировали на наличие вставки методом ПЦР со специфическими праймерами к гену. Последовательность гена определяли секвенировани-ем (ИБ РАН) с использованием универсальных праймеров Т7.
Получение штаммов-суперпродуцентов и наработка a-, ß-, у-субъединиц SsoIF2. Для получения штаммов-суперпродуцентов использовали систему Штудиера [29]. Клетки E. coli штамма BL21(DE3) трансформировали полученными рекомбинантными плазмидами pET11c-sso_a, pET11d-sso_ß, содержавшими под контролем Т7-промотора гены а- и ß-субъединиц соответственно. Плазмидой pET11c-sso_/, содержавшей ген у-субъединицы, трансформировали клетки E. coli штамма C41(DE3). Трансформированные клетки засевали в среду LB с ампициллином с концентрацией 100 мкг/мл, растили при 37° с интенсивным перемешиванием (200 об/мин) до поглощения (^600) 0,8 о.е/мл. После этого добавляли ИПТГ до конечной концентрации 1 мМ и продолжали инкубировать клетки в тех же условиях в течение 3 ч. Затем клетки осаждали центрифугированием при 5000 g 20 мин при 4°. Уровень продукции субъединиц SsoIF2 оценивали электрофорезом в 15%-ном ПААГ в присутствии Ds-Na методом Лэммли [30]. Гели окрашивали кумасси G-250.
Выделение и очистка полного гетеротримера SsoIF2. Их осуществляли по методике, описанной ранее [26], со значительными изменениями. Клетки штаммов-суперпродуцентов каждой из трех субъединиц SsoIF2 ресуспендировали отдельно в буфере А (0,01 М Hepes-KOH, pH 7,5, 0,1 М NaCl, 0,1 мМ ЭДТА, 10 мМ ß-меркапто-этанол) и разрушали ультразвуком. Разрушенные клеточные стенки и мембраны убирали центрифугированием в течение 20 мин при 14 000 g и 4°. Полученные супернатанты прогревали при 65° в течение 20 мин и затем снова центрифугировали в тех же условиях, чтобы удалить термолабильные белки E. coli. Супернатанты, ка
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.